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精選干貨丨光學表面等離子共振儀SPR技術應用合集來了

來源：測試GO 時間：2023-02-16 14:06:58 瀏覽：8553次

發展歷史

表面等離子共振技術（Surface Plasmon Resonance，SPR）起源于上世紀初，是一種新型光學檢測技術。它能簡單快捷的監測DNA與蛋白質之間、蛋白質與蛋白質之間、藥物與蛋白質之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間、受體與配體之間等等生物分子之間的相互作用，因而廣泛應用于生物醫藥領域。

1902年，Wood等人在一次光學實驗中，首次發現了SPR現象并對其做了簡單的記錄，但直到39年后的1941年，一位名叫Fano的科學家才真正解釋了SPR現象。

之后的30年間，SPR技術并沒有實質的發展，也沒能投入到實際應用中去。1971年Kretschmann等人為SPR傳感器結構奠定了基礎，也拉開了應用SPR技術進行實驗的序幕。

1983年，Liedberg等人首次將SPR用于抗原抗體的反應測定并取得了成功。

1987年，Knoll等人開始研究基于SPR技術的成像設施。

1990年，Pharmacia Biosensor AB公司（現為Cytiva公司）開發出了首臺商品化SPR儀器，為SPR技術更加廣泛的應用開啟了新的樂章。自此，隨著科技的日新月異，SPR技術逐漸完善，其檢測系統也愈發成熟。

基本結構及原理

SPR的核心部件包括光學系統、傳感器芯片、液體處理系統三個主要部分，其他的組成部分包括LED狀態指示器及溫度控制系統等。其中：

光學系統的核心是能夠產生和測量SPR信號的光電組分，該組分又被稱為光學檢測單元；

傳感器的芯片是SPR最為核心的部件。在SPR技術中必須有一個生物分子偶聯在傳感片上，然后用它去捕獲可與之進行特異反應的生物分子。傳感芯片又分為三個主要組成部分，分別是光波導耦合器件、金屬膜以及分子敏感膜。

液體處理系統包括兩個液體傳送泵，其中一個泵負責保持穩定流速的液體流過傳感芯片表面，另一個泵負責自動進樣裝置中的樣品傳送。

通常，當入射的p-偏振光以特定的角度在棱鏡內傳播到金屬膜表面發生全反射現象時，光無法穿過兩種介質的臨界面，但會沿著臨界面平行的方向產生光波，即消逝波。在發生全反射現象的同時，入射光會與金屬薄膜表面的等離子體（價電子）相互作用引起電子系統的集體震蕩。因庫侖力的存在使得這種現象反復進行，進而形成等離子振蕩，以波的形式表現即等離子波。當消逝波和等離子波的方向和頻率相同時，就產生了SPR現象。

發生SPR現象時，金屬自由電子通過共振吸收光能量，導致反射光強度明顯降低，此時光的入射角被稱為共振角。研究發現，SPR現象的共振角的大小與金屬膜電介質的折射率密切相關。在利用SPR技術檢測目標物時，需要將能與待測物結合的生物靶分子鍵合在金屬膜表面。當含有目標物的溶液經過傳感器的金屬膜表面時，發生目標物和生物靶分子的特異性結合反應，由此引發了金屬膜表面折射率的變化，同時光路系統監測到的SPR共振角也發生變化，進一步實現對目標分析物定量的目的（圖1）。

圖1 SPR的構造及原理示意圖

應用案例解析

與傳統檢測分子相互作用方法相比，SPR技術具有操作簡單、耗時短、靈敏度高、可以無標記地實時測量動力學數據等優點。因此，SPR應用逐漸趨向多樣化，在各種生物檢測（蛋白質、病毒分子等）、傳感器甚至儲能催化領域都有著廣泛應用。下面，筆者就列舉SPR近期的部分最新熱點成果，帶領大家一窺“廬山真面目”！

實例1 檢測蛋白-小分子間的相互作用

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c04986

在蛋白質中，芳香族氨基酸的殘基通過各種π相互作用在調節蛋白-配體結合過程中起到關鍵作用，例如π-π，cation-π，和CH-π等。雖然π相互作用很早就成為蛋白質功能研究的一個熱點，但是π作用機制以及作用力大小尚不清楚。其中的一個主要原因在于試驗技術方法有限，無法監測由于蛋白微環境改變從而導致的π作用力變化。

有鑒于此，荷蘭格羅寧根大學Broos等人通過氨基酸衍生物策略對芳香環π電子云強度進行微改變，從而來研究并定量分析蛋白質中的π作用力。作者首先確定以LmrR蛋白作為模型來研究π-π相互作用機制及作用力大小，并選取了一系列含有氟原子取代基的色氨酸衍生物來替換LmrR蛋白中的W96位置（圖2）。質譜分析確定超過95%的W96被替換成相應的色氨酸衍生物。

采用SPR技術，作者發現隨著色氨酸衍生物中氟原子取代基數量增加，衍生物標記的LmrR蛋白與芳香小分子之間的親和力（K_d）逐漸降低。其中LmrR蛋白與Riboflavin（RBF）的親和力降低了近70倍，表明該親和力很大程度上取決于色氨酸芳香環上π電子云強度（圖3）。

最后，作者采用同樣手段檢測了膜蛋白RibU以排除蛋白類型可能造成的結果偏差性，結果與LmrR模型一致。該研究將為藥物設計、酶工程和蛋白設計等提供重要的理論依據。

圖2 各種色氨酸衍生物標記的LmrR蛋白的晶體結構

圖3 LmrR蛋白與芳香小分子之間的親和力與氟原子取代基數量的關系

實例2 檢測蛋白-蛋白間的相互作用

原文鏈接：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2021110518

全球氣候變化導致的異常低溫，嚴重影響了農作物（水稻）的生產，培育具有異常溫度耐受的品種是解決這一問題的重要途徑。農作物的品種分子設計技術依賴于細胞感知溫度信號的轉導網絡機制，細胞中溫度感受器是信號網絡的源頭，而溫度感受器如何將溫度物理信號轉換成化學信號，其機制尚不明晰。

有鑒于此，中科院植物所種康等人根據分子遺傳學、生理生化和生物物理學等多學科融合策略，發現水稻細胞中鈣網蛋白復合物OsCRT3-OsCIPK7可以通過蛋白構象的改變感知低溫物理信號，并使其轉換成細胞內的生化網絡信號（圖4）。SPR實驗數據顯示低溫下OsCRT3和OsCIPK7兩種蛋白的特異互作增強，表現為在低溫下更快的結合速率（K_a）和更慢的解離速率（K_d），結合常數K_D（K_d/K_a）減小，進而增強OsCIPK7的激酶活性，從而賦予水稻更高的寒害耐受性（圖5）。該研究首次發現了溫度感知的新機制，即通過蛋白的構象改變感知溫度信號，并產生下游的效應。該發現具有重要的理論意義，同時也為分子設計育種提供了新的基因模塊資源。

圖4 低溫誘導OsCRT3-OsCIPK7蛋白分子間相互作用改變示意圖

圖5 OsCRT3和OsCIPK7兩種蛋白分子間的相互作用

實例3 SPR用于生物傳感器

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590006422002423?via%3Dihub

基因療法能從根本上補充或修復缺陷基因，恢復健康基因的正常生物學功能，具有不可比擬的治療優勢。腺病毒或腺相關病毒（AAV）已經成為預防感染、嚴重疾病和死亡的理想基因治療和疫苗載體。載體進入體內誘導免疫反應并建立免疫記憶需要一種具有傳染性的活性病毒疫苗。然而受到病毒載體碎片干擾，精確測定病毒疫苗載體的效價濃度十分困難，進而嚴重影響基因藥物或疫苗的生產質量控制以及精準給藥。因此，迫切需要一種可準確測定病毒載體的濃度和存活力的新技術。

有鑒于此，華中科技大學劉鋼、黃麗萍團隊與華中農業大學金梅林、張強團隊合作，研發了一種具有納米級多功能機器人手結構的納米等離子體（Nano RHB）生物傳感器，用于快速、無損和特異性地捕獲和定量檢測腺病毒顆粒。

采用SPR技術，作者通過聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形狀的分枝狀金納米結構。這些分支金納米結構的功能類似于智能機器人手，從而增強SPR共振效應以提高芯片的靈敏度，同時增加表面積以提高芯片修飾效率（圖6）。將這些超靈敏生物傳感器集成到標準96孔板或32孔板中，可以直接監測動態結合曲線，并使用微量樣品定量檢測腺病毒載體或疫苗。

此外，研究人員使用凍干技術將CAR蛋白標記的金顆粒整合到單克隆抗體修飾的Nano RHB平臺上時，檢測靈敏度可以進一步提高5倍，在5分鐘內同時高通量檢測多達96個樣品，且檢測靈敏度提升至100 copies/mL，比傳統病毒滴度檢測方法更高效快捷（圖7）。

圖6 使用Nano RHB定量病毒顆粒原理示意圖

圖7 基于CAR包覆的Nano RHB平臺在5分鐘內無標記檢測腺病毒

實例4 SPR用于催化

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2773045X22000140?via%3Dihub

近年來，通過表面等離子體共振（SPR）來增強化學反應已成為催化領域的一個研究熱點。SPR效應是金屬納米顆粒所具備的特殊光學性質，其可根據金屬的成分、形狀和尺寸進行調整。這種可調諧的光-物質相互作用為生物學、傳感和人工光合作用領域提供了可能性。然而，當SPR金屬與分子相互接觸時，其SPR衰減速率會受到嚴重影響，相關機理的繁雜依然困擾著研究人員。

有鑒于此，山東大學黃柏標、鄭昭科團隊設計了一種光輔助調控Au納米棒幾何結構的方法，合成了具有不同縱橫比的Au納米棒（Au NRs-L、Au NRs-M 和Au NRs-S），并通過單顆粒光譜技術結合宏觀實驗和時域有限差分模擬（FDTD），實現了對單個Au納米棒光致縮短的原位觀察以及對催化過程的原位觀測。

研究表明，在鈀（Pd）離子的輔助下，納米棒的縱向長度隨光照時間逐漸縮短，而其徑向長度保持不變。當將甲酸分子注入樣品池時，觀察到Pd-Au納米棒的熒光（PL）猝滅，證實了Pd-Au納米棒和甲酸分子間的電荷轉移。最后，通過將單顆粒PL測量與FDTD、DFT計算相結合，闡明了SPR誘導的甲酸脫氫催化機制。這項工作有助于理解SPR衰減機制與納米結構之間的關系，并對SPR誘導甲酸脫氫催化提供了指導。

圖8 光輔助設計策略示意圖及不同Au納米棒對應的光譜

圖9 SPR誘導HCOOH脫氫的催化機理示意圖

參考文獻

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