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項目介紹

通過轉錄組學的研究以揭示生物學現象或疾病發生的分子機制是高通量組學研究的一個常用策略。利用高通量測序技術在全面快速得到基因表達譜的同時，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉錄本的SNP、可變剪接等序列及結構變異。

技術特點

1.除了計算基因的表達水平，更可以檢測轉錄本的序列和構變異。

2.測序深度的增加可以獲得更廣的動態檢測范圍，能夠同時鑒定和定量高豐度轉錄本和低豐度轉錄本，信號強度的跨度可達6個數量級。

3. 除了檢測已知轉錄本的表達水平外，還能夠發現新的轉錄本。

4. 在應用于尚無參考基因組的物種時，可以通過從頭組裝發現新基因。

實驗流程

圖中深色為該實驗流程

分析流程

標準分析

（1）數據過濾及比對分析

（2）轉錄本拼接

高級分析

（3）差異表達基因篩選

（4）差異表達基因聚類分析

（5）使用GO/KEGG分析，推測突變基因富集在哪些代謝通路。

樣品要求

樣本要求

RNA濃度≥20ng/ul ，總量≥2ug

細胞數≥5X10⁶

項目案例

常見問題

1、真核轉錄組常規建庫流程

1）通過磁珠和mRNA的polyA結構將mRNA分離出來；

2）mRNA片段化；

3）mRNA反轉錄為雙鏈結構，第二鏈cDNA合成時，其中的堿基T，被替換成U，從而達到鏈特異性文庫的目的；

4）5’末端修復、3’末端加A；

5）加接頭；

6）選擇特異長度回收，一般為300bp；

7）PCR；

8）上機測序。

2、原核轉錄組測序用到哪些試劑？

1）RNA提取：Trizol Reagent；

2）核糖體RNA去除：IlluminaRibo-Zero? Magnetic Kit；

3）文庫構建：IlluminaTruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit；

4）上機測序IlluminaNextSeq?500 High Output Kit v2。

3、什么是小RNA測序？

Small RNA測序，研究某一物種特定組織在特定狀態下的已知SmallRNA，也可發現新的或該物種的Small RNA并預測其靶基因，為研究Small RNA的功能及此物種的基因調控機制提供了有力工具。Small RNA主要包括微RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、與piwi相互作用的RNA（piRNA）三類。

4、哪些物種可以研究lncRNA？

要做lncRNA分析，對物種有以下要求：

a. 物種為真核生物；

b. 物種具有參考基因組；

c. 具有較為完整的注釋。

5、為什么CircRNA測序的研究比較熱？

1）多角度闡述分子生物學問題的需要；

2）從新的角度發現導致樣本存在差異的需要；

3）尋找影響疾病發生的分子標記；

4）探究circRNA的未知功能；

5）尋找導致microRNA表達發生變化的機理。

6、全轉錄組測序是怎么做的？

全轉錄組測序是將樣品分為兩份，構建2個文庫，1個小RNA文庫（包含miRNA）和一個去除核糖體的鏈特異性文庫（包含mRNA，lncRNA，和circRNA），然后分別上機測序，最后主要獲得4類RNA——miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA的序列信息。

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