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利用動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 進(jìn)行單克隆抗體測(cè)量?

來源：藥時(shí)空時(shí)間：2022-10-26 13:55:31 瀏覽：5269次

動(dòng)態(tài)光散射 (Dynamic light scattering，DLS) 是一種強(qiáng)大的方法，適用于測(cè)量生物樣品，尤其是蛋白質(zhì)和生物聚合物。

蛋白質(zhì)被用作免疫分析和其他快速診斷、疫苗制造中的主要功能成分，以及廣泛的可注射蛋白質(zhì)藥物的主要成分。

在這些應(yīng)用中的每一個(gè)中，抗體保持完整和單體是至關(guān)重要的。忽視遵循這些嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)會(huì)損害基于抗體的產(chǎn)品的可加工性、活性和穩(wěn)定性。

充分利用DLS，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的聚集，并且可以非常準(zhǔn)確地確定單體蛋白質(zhì)的大小。為了證明這一理論，將對(duì)單克隆抗體 (mAb)藥物進(jìn)行的聚集研究與針對(duì)常見蛋白質(zhì)血清白蛋白 (BSA) 獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。

介紹

DLS 依賴于自由漫射材料，由于布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)傳播，將在散射激光中產(chǎn)生快速變化的原理。這些強(qiáng)度波動(dòng)的時(shí)間尺度需要幾十納秒到幾百毫秒。這些變化與粒子的運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)。獲得從激光散射強(qiáng)度產(chǎn)生的信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為自相關(guān)函數(shù)。這是測(cè)量粒度分布的基礎(chǔ)。

許多經(jīng)常出現(xiàn)的球狀蛋白質(zhì)的流體動(dòng)力學(xué)尺寸很小。蛋白質(zhì)單體通常小于10nm，其中許多小至1nm或更小。需要高速相關(guān)器來測(cè)量這種快速擴(kuò)散的蛋白質(zhì)的大小。蛋白質(zhì)聚集體可以輕松地獲得數(shù)百納米或更多的大尺寸。部分聚集蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品在流體動(dòng)力學(xué)尺寸上可擴(kuò)展超過1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。在這種情況下，難點(diǎn)在于選擇合適的相關(guān)儀器以完全解析這些信號(hào)。如下所述，相關(guān)器的可配置性對(duì)于評(píng)估具有挑戰(zhàn)性的異質(zhì)生物樣品至關(guān)重要。

應(yīng)該注意的是，從DLS獲得的直徑，通常稱為流體動(dòng)力學(xué)直徑(dh)，與擴(kuò)散系數(shù)(Dt)成反比。在DLS中測(cè)量的Dt與流體動(dòng)力學(xué)大小dh之間的關(guān)系是相反的，由斯托克斯-愛因斯坦方程提供：

Dt=kBT/3πηdh

其中玻爾茲曼常數(shù) (kB)、溫度 (T) 和體積粘度 (η) 都是既定值。這個(gè)表達(dá)式可以簡(jiǎn)化為：

Dt∝1/dh

光散射的慣例是將小散射角表示為前向散射，將大散射角表示為后向散射。反向散射，通常是指遠(yuǎn)大于90度的角度，非常常用于測(cè)量單體大小的小蛋白質(zhì)的尺寸。相反，前向散射對(duì)較大的物種特別敏感，可用于識(shí)別甚至微量聚集蛋白質(zhì)的存在。對(duì)于既定的散射角θ和折射率n，散射矢量q由以下表達(dá)式確定：

q=4πn/λosin(θ/2)

已建立的相關(guān)函數(shù)C(τ)被解卷積為單指數(shù)、拉伸指數(shù)或指數(shù)的總和。此目的的不同元素可分為特征衰減率 Г，通常另外還有多分散指數(shù)。該 Г 與平移擴(kuò)散系數(shù) (Dt)相關(guān)聯(lián)，如下所示：

Г=Dtq2

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的中等大小的球狀蛋白質(zhì)，可以看到小至數(shù)百s-1和大至50000s-1的衰減率(Г)，這取決于散射角。可配置的相關(guān)器布局提高了測(cè)量如此廣泛的衰減率的能力。如下圖所示，對(duì)于BSA，對(duì)于既定大小的粒子，Г線性地受 q2的影響。在最可能的應(yīng)用中，可以采用單個(gè)角度的DLS來求解Dt，從而獲得突出顯示的蛋白質(zhì)的直徑。常見的 DLS 配置，尤其是臺(tái)式儀器，通常具有后向散射、直角和前向散射（θ=173o、90o和 15o）。

作為散射角θ函數(shù)的血清白蛋白單體的DLS結(jié)果。有效dh=7.5nm。為了使Гvsq2相關(guān)性有用，最少需要4-5個(gè)散射角。

反向散射可用于確定蛋白質(zhì)單體的大小。通常，反向散射角有助于測(cè)量含有游離蛋白質(zhì)和聚集蛋白質(zhì)的樣品。反向散射角減少了較大顆粒方向上的固有強(qiáng)度偏差，否則可能會(huì)掩蓋單體蛋白質(zhì)的散射。

前向散射對(duì)聚集極其敏感。與反向散射角相比，極低的角度對(duì)大顆粒特別是那些大于1000nm的顆粒極其敏感。盡管前向散射對(duì)聚集體的存在極為敏感，但后向散射對(duì)于精確確定可能與聚集材料共存的任何小顆粒的大小更有用。

在五個(gè)單獨(dú)的散射角獲得的相關(guān)函數(shù)，θ=(30,150° )。二次衰變的存在在兩個(gè)最低角度變得明顯。

在反向散射中計(jì)算時(shí)，血清白蛋白看起來是單體的。如果僅在反向散射角處進(jìn)行DLS 測(cè)量，則很容易將BSA的散射與純單體的散射相混淆。在最小的角度（30和45度），第二次衰變的存在是顯而易見的。向較慢擴(kuò)散方向的轉(zhuǎn)變，或較小的Г，表明存在較大的粒子。這表明大而緩慢移動(dòng)的粒子，可以想象聚集的蛋白質(zhì)，需要與單體蛋白質(zhì)共存。

BSA是一種傳統(tǒng)的血清蛋白，經(jīng)常被用作與藥物相關(guān)的蛋白質(zhì)（如抗體）的替代品。這種小的球狀蛋白質(zhì)以單體、二聚體和有時(shí)三聚體的形式存在。在生理pH值下，可能會(huì)出現(xiàn)極少量的BSA聚集。相比之下，抗體是大而適應(yīng)性強(qiáng)的蛋白質(zhì)，具有緊湊的亞基，由許多脆弱的內(nèi)部二硫鍵結(jié)合在一起。化學(xué)降解的抗體可能會(huì)聚集或產(chǎn)生低分子量的抗體片段。

可以使用單個(gè)角度簡(jiǎn)單地測(cè)量單體mAb。如下所示，可以在單個(gè)散射角θ=90度下有效地測(cè)量穩(wěn)定的單體單克隆抗體。該測(cè)量產(chǎn)生大約12nm的有效直徑，以及接近零的低多分散性。相關(guān)函數(shù)最好定義為單個(gè)指數(shù)衰減，這意味著樣本的特征簡(jiǎn)單且均勻，沒有注意到聚集。

以90度散射角測(cè)量的稀釋單克隆抗體顯示單個(gè)有效直徑約為11.6nm。

化學(xué)應(yīng)激單克隆抗體的DLS產(chǎn)生與2-3個(gè)主要成分的相關(guān)函數(shù)，其中主要成分是聚集蛋白。

該樣品（上圖）顯然由許多離散且定義明確的群體組成，正如對(duì)由聚集蛋白和游離蛋白組合組成的樣品所預(yù)期的那樣。相比之下，化學(xué)應(yīng)激抗體不能以由單一衰減常數(shù)組成的模型為特征，也不能被顯著標(biāo)記為連續(xù)分布的粒徑。由于這些Г在s-1中跨越多個(gè)數(shù)量級(jí)，因此它們只能通過謹(jǐn)慎選擇包含各種延遲時(shí)間（高速、中速和低速通道）的相關(guān)器布局來解決。

當(dāng)采用多峰粒徑分布時(shí)，只要采用適當(dāng)?shù)纳⑸浣?(θ≥90度) ，游離單體抗體峰就可以從聚集峰中完全分離出來。很明顯，選擇大的散射角（下圖）增強(qiáng)了解決許多快速衰減的能力。

作為散射角θ和散射矢量q2的函數(shù)的多峰分布的可分辨性。

考慮選擇由各種延遲時(shí)間(τ)和散射角組成的相關(guān)器布局，即使存在極度聚集的蛋白質(zhì)，也可以極其精確地測(cè)量單體mAb。應(yīng)注意Г1,Г2,Г3在15與155度的分辨率上的差異。

回顧

1、選擇最佳散射角對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)量具有挑戰(zhàn)性的生物樣品至關(guān)重要。

2、恒定的多角度測(cè)量可能會(huì)有所幫助，特別是當(dāng)開始時(shí)聚合和單體蛋白質(zhì)的未確定組合。盡管如此，這對(duì)于可靠、均質(zhì)的蛋白質(zhì)樣品來說通常是不必要的。

3、應(yīng)該注意的是，前向散射表示非常小的角度，而后向散射表示大角度。臺(tái)式儀器通常具有三個(gè)固定的散射角，前向、直角和后向散射。

4、關(guān)鍵點(diǎn)：

（1）背向散射有助于小顆粒或混合物的高精度測(cè)量。

（2）低角度對(duì)較大的顆粒極為敏感；這就是前向散射有助于識(shí)別甚至少量蛋白質(zhì)聚集體的原因。

（3）前向散射角雖然有助于識(shí)別聚集，但在量化許多共存物種的大小時(shí)不太有用。

結(jié)論

蛋白質(zhì)聚集體可以很容易地達(dá)到數(shù)百納米或更大的大尺寸，這使本已困難的測(cè)量變得復(fù)雜。這一原理通過一種適用于藥學(xué)的蛋白質(zhì)、單克隆抗體(mAb) 展示，在其單體和聚集狀態(tài)下進(jìn)行檢查。盡管它具有異質(zhì)性，考慮到相關(guān)器布局和散射角的選擇允許來自單體mAb的信號(hào)的全分辨率，盡管存在化學(xué)誘導(dǎo)的聚集體。

來源：藥時(shí)空

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