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一文解讀等溫量熱滴定儀 || 生物熱力學與動力學研究新技術

來源：時間：2025-03-07 10:17:55 瀏覽：4563次

提起熱分析技術，大家最先想起的必然是熱重分析/差熱分析/差示掃描量熱法“三巨頭”，這三種熱分析技術廣泛應用于材料、物理、化學等領域的研究中。然而再經典的測試技術總有鞭長莫及的地方，分析技術的空白需要源源不斷的新技術來填充。今天，小GO就給大家介紹一種主要用于生物學領域研究的微量熱儀器——等溫量熱滴定儀（isothermal titration calorimetry，ITC）。ITC可以通過檢測樣品池補償功率的變化，以參加反應的物質總濃度變化和反應的熱量變化為函數，并結合一定的數學模型獲取熱力學參數。一次ITC實驗即可計算出結合常數（KA）、解離常數（KD）、結合化學計量比（Δn）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）等熱力學參數。高靈敏度、高自動化的等溫量熱滴定儀能夠原位、在線和無損傷地同時提供熱力學和動力學信息，是近年來發展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要方法。

圖1 等溫量熱滴定儀^[^1]

1. 工作原理

在ITC儀中，有兩個加樣池，一個是含有水的參比池，另一個是包含目標蛋白質的樣品池，二者之間通過一個熱電偶回路相連，確保樣品池和參比池處于完全相同的溫度（圖2a）。樣品池和參比池側分別有一個加熱器，在實驗過程中分別對樣品池和參比池進行加熱，實驗過程中加熱器的功率補償會被同步記錄下來并用于后續的熱分析，具體的操作流程如下：

① 在參比池中加入參比物，將反應物置于樣品池中，將參比池和樣品池設置為所需的實驗溫度；

② 將含有配體的滴定劑（通常是小分子）裝入注射器并加入樣品池，一系列的小份配體等分試樣被依次注入到目標反應物的蛋白質溶液中；

③ 樣品與滴定劑發生吸熱/放熱反應會導致樣品池與參比池的溫差發生變化，反應變化的能量被熱敏裝置靈敏的檢測到，靈敏度可達到百萬分之一攝氏度；

④ 每注入一份配體滴定劑后，量熱儀都會進行一次測量，所測得的熱量與反應結合量成正比；

⑤ 以放熱反應為例，注入配體后與樣品發生反應，樣品池的溫度高于參考池，儀器記錄下降峰信號，加熱裝置對參考池供給更多的熱量，等到兩側溫度恢復一致之后，信號峰就返回到起始位置；

⑥ 經過一系列配體注射，配體和樣品之間的摩爾比逐漸增加，樣品中的活性成分越來越少，反應結合量減少，每注入一份配體后的熱量變化也在減小，直到最終樣品池中的樣品飽和，熱量變化趨近為零；

⑦ 等溫量熱滴定儀將一系列的變化數值記錄下來，即可獲得量熱曲線（圖2b）；

⑧ 將每個峰的面積進行積分，并以配體與樣品的摩爾比為橫坐標進行繪圖，生成的等溫線（熱量峰曲線，圖2c）可用于擬合計算得出焓ΔH，結合擬合方程可獲得親和力K_D，結合等溫線中心的摩爾比可以獲得反應化學計量數。

圖2 等溫量熱滴定儀工作原理^[^3]

1.1 量熱滴定or滴定量熱？

ITC的中文名主要有“等溫量熱滴定儀”和“等溫滴定量熱儀”兩種，這是根據它的測試原理和流程命名的。總的來看，ITC的測試流程主要分為兩部分：功率補償和譜圖分析。ITC的實驗數據以熱譜圖形式表示，它提供了有關反應中物質的量(滴定終點)和反應物質的特性(變)的數據。對圖進行分析，可以得知反應容器中發生的反應的類型和數目，以及溶液中存在的各物種的濃度等信息。這部分內容稱為熱滴定。同時還可以確定反應的化學計量關系，計算反應的熱力學量如平衡常數K(ΔG°)、標準狀態下的焓變ΔH°和熵變ΔS°這部分內容稱為滴定量熱法^[^4]。

1.2 為什么可以用微量熱法研究分子間相互作用？

分子間相互作用過程中價鍵的形成和破壞需要釋放或者吸收能量，絕大部分化學和生化過程也都伴隨著熱量的吸收和釋放，這是ITC儀測試分析的根本原理。微量熱檢測的是最基本、最普遍的物理量-熱量變化，這是ITC儀的測試原理。儀器靈敏度的提高讓檢測mcal或者ncal水平的熱量成為可能，樣品的用量也隨著儀器設計的進步而減少到可以接受的程度，這是ITC儀實現微量研究的原理。被分析的樣品始終處于天然的溶液狀態和構象，無需修飾。測試過程非光學檢測，樣品顏色、內在熒光、透明度對實驗沒有影響。熱量測定可以在廣泛的溶液環境和溫度條件下進行，這是ITC儀能對廣泛的樣品進行測試分析的原理。

2. 樣品制備要求

(1) 緩沖液要求

a. 為了降低背景熱，實驗需要的兩種分子的緩沖液必須一致；

b. DMSO的稀釋熱非常高，因此需要樣品池與滴定針里的DMSO濃度高度一致；

c. pH值的微小差異也會引起很高的稀釋熱，因此建議提前用透析液稀釋樣品；

d. 還原劑會引起顯著的基線漂移和假陽性，特別是當焓變很小的時候。可用TCEP代替β-Me和DTT，濃度盡可能的低于1mM；

e. 建議提前對緩沖液脫氣，可有效減少氣泡，提高數據質量。

(2) 樣品要求

a. 一次實驗需要的體積：≥ 350 μL 蛋白（樣品池）；≥ 60 μL 配體（滴定針）；

b. 可嘗試的初始濃度：5-50 μM 蛋白 (至少 10x Kd)；50-500 μM 配體 (≥10x 樣品池濃度)；

c. 測試前要對樣品做離心或過濾處理，并精確測定樣品的摩爾濃度。

(3) 減少誤差

a. 樣品池中的濃度誤差會影響 stoichiometry，滴定針中的濃度誤差會直接影響K_D，ΔH和n；

b. Protein aggregates 會干擾ITC實驗；

c. 可用光散射評價蛋白的均一性，純化的蛋白樣品如果有可溶性的聚集可以通過 size-exclusion chromatography 去除；

d. 試驗前后要使用緩沖液對裝樣針、樣品池、參比池進行潤洗。

(4) 樣品前處理

a. 準備約50mL的緩沖溶液（用來潤洗樣品池及注射器，或者實驗結束后先用緩沖溶液清洗樣品池）；

b. 將樣品（滴定物和被滴定物）及上述的緩沖溶液一起放入degassing station 脫氣處理；

c. Degassing station 設置溫度（測試滴定實驗溫度），真空度400mmHg以上，脫氣時間10min。

3. 應用范圍

蛋白質-蛋白質相互作用(包括抗原-抗體相互作用和分子伴侶-底物相互作用)；蛋白質折疊/去折疊；蛋白質-小分子相互作用以及酶-抑制劑相互作用；酶促反應動力學；藥物-DNA/RNA相互作用；RNA折疊；蛋白質-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-細胞相互作用^[^5]。

4. 技術優勢

1) 無需標記：直接測定最普遍的熱量變化，無需通過熒光標記或固定化技術對結合配偶體進行修飾；

2) 在一次ITC實驗中可以獲得有關結合反應的大量信息，有助于了解相互作用的性質并探索其熱力學驅動因素；

3) 非特異性：基本上兼容任何緩沖或添加劑。測溫滴定法以熱效應為基礎，與溶液的許多性質(如粘度、光學透明度、介電常數、溶劑強度、以及離子強度等)無關，因此可以用于氣相、液相非水溶液、有色溶液、膠體溶液和粘稠漿狀等體系，對被研究體系的溶劑性質、光譜性質和電學性質等沒有任何限制條件；

4) 樣品用量小，方法靈敏度和精確度高。儀器最小可檢測熱功率2 nW，最小可檢測熱效應0.125 μJ，生物樣品最小用量0.4 μg，溫度范圍2 - 80 ?C，滴定池體積小(1.43 ml)；

5) 響應速度快，測試時間短：一次實驗時間只需30-60分鐘；

6) 操作簡便：整個實驗由計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數，如溫度注射次數、注射量等，計算機就可以完成整個實驗，再由Origin軟件分析ITC得到的數據，易上手，人工誤差小；

7) 無損性：測量時不需要制成透明清澈的溶液，而且量熱實驗完畢的樣品還可以進行后續生化分析；

8) 非特異性：生物體系本身具有特異性，因此ITC這種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結果，這有助于發現新現象和新規律，特別適應于研究生物體系中的各種特異過程。

5. 應用范例

(1) ITC研究蛋白質-酶的相互作用

纖維素是地球上最豐富的可再生性自然資源，木質纖維材料生物質的全利用是對于人類來說最為重要的生物技術之一。纖維素酶現在已經被越來越多的應用于工業領域，特別是去垢劑中的應用，因此研究去垢劑和纖維素酶的相互作用及其在去垢劑中的穩定性影響就顯得尤為重要。武漢大學生命科學學院的研究者們^[6]采用特異性的熒光滴定法結合非特異性的ITC測試法，對陰離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和綠色木霉纖維素酶的相互作用進行了研究。

15 ?C下SDS和纖維素酶結合的ITC曲線和由此擬合的非線性擬合曲線如圖3所示。從圖3a可以看出，SDS與纖維素酶的結合反應為放熱反應，隨著SDS濃度從0.35 mmol/L增大到8.2 mmol/L，結合反應趨于飽和，滴定曲線逐漸減小。采用獨立結合位點模型模擬出該過程的本征結合常熟、本征摩爾結合焓和纖維素酶的SDS結合位點數分別為K_b=126±23 L/mol，Δ_bH⁰_m=-3.49±0.24 kJ/mol和n=42.5±0.7。

不同溫度下SDS和纖維素酶結合的熱力學數據列在表1中。從測試結果也可以看出，隨著溫度的升高，K_b總體上是下降的，但30 ?C的K_b反而比25 ?C的數據稍大，這可能是由于SDS結合纖維素酶的親和力較弱。本文的實驗結果表明，SDS結合綠色木霉纖維素酶的親和力較弱，為較小的放熱反應，并伴隨著一定程度的熵增，屬于焓和熵共同驅動的反應。該結合過程的焓變和熵變強烈地依賴于溫度，但其Gibbs自由能幾乎與溫度無關，表明該結合過程中存在著顯著的焓-熵補償作用。

圖3 SDS與綠色木霉纖維素酶結合的ITC曲線

表1 SDS與綠色木霉纖維素酶結合的熱力學參數

（2） ITC研究糖-蛋白質相互作用

核糖開關(riboswitch)是位于mRNA非編碼區域的RNA元件，可與小分子配體結合導致結構轉變，進而調控下游基因的表達。核糖開關aac能夠特異性結合氨基糖苷類抗生素，從而調控氨基糖苷類抗生素抗性基因的表達。目前，核糖開關aac與氨基糖苷類抗生素相互作用的位點和機制尚不清楚。復旦大學生物醫學研究院的研究者們使用ITC法對核糖開關aac與氨基糖苷類抗生素的結合親和力及結合熱力學性質進行了研究，并初步討論了點突變對相互作用的影響^[^7]。

RNA與小分子的相互作用需要合適的構象，因此，進行等溫滴定實驗前需將RNA進行退火處理。實驗前RNA溶液在95 ?C變性5 min，金屬浴退火4 h，滴定樣品須在4 ?C下12000 r/min離心10 min去除氣泡，隨后再進行ITC實驗，獲得的補償功率隨時間變化的曲線圖和反應熱隨摩爾比變化的曲線圖如圖4所示。

圖4 ITC反應中補償功率隨時間變化的曲線圖和反應熱隨摩爾比變化的曲線圖

圖中，鏈霉素滴定核糖開關aac的反應熱曲線呈散點狀，表明鏈霉素不能結合核糖開關aac，西索米星、慶大霉素、G418、奈替霉素、巴龍霉素與核糖開關aac有特異性相互作用；阿米卡星、卡那霉素A、鏈絲菌素、鏈霉素、新霉素、新霉胺、核糖霉素與核糖開關aac沒有特異性相互作用。對反應熱函數用One Set of Sites模型(圖2中黑色實線)進行擬合，得到結合反應的焓變、熵變、結合常數和化學計量比，結果表明在與核糖開關aac特異性結合的五種氨基糖昔類抗生素中，奈替霉素與核糖開關aac的結合親合力最強，為1.68 μmol/L；巴龍霉素與核糖開關的結合親合力最弱，為13.02 μmol/L。

根據結合熱力學和核糖開關aac的二級結構推斷，核糖開關aac與氨基糖昔類抗生素的結合發生在A18和U68之間，核糖開關aac中的A13和A44也影響核糖開關aac與氨基糖昔類抗生素的結合。這些結果對進一步研究核糖開關aac與氨基糖苷類抗生素相互作用的位點和機制具有重要的參考價值。

6. 總結

等溫滴定量熱法（ITC）是一項可實時、定量、在線和動態描述反應過程的熱分析技術，能夠給出主客體相互作用的結合常數、解離常數、結合化學計量比、焓變和熵變等熱力學參數。該技術具有量熱靈敏度高、測量準確、適用范圍廣、非特異性等優點，可以研究小分子-蛋白質作用、蛋白質-蛋白質相互作用、酶促反應動力學等生物學及藥學反應特性，廣泛用于研究臨床用藥相容性、DNA/RNA變異特性、藥物制劑等領域。由于ITC的測量依據是檢測的是最基本、最普遍的物理量-熱量變化，因此檢測準確性高，而且儀器檢測靈敏度高，是生物學領域最有效的測試分析方法之一。

參考資料

[1] http://www.tongdafittings.com/sycs/714.html

[2] http://www.tongdafittings.com/article/11243.html

[3] https://www.bilibili.com/video/av96496262/

[4] 齊心潔，王玥，王彥晟，方國康，黃迎春.等溫滴定量熱法在蛋白質-配體相互作用中的應用[J].生物技術通報，2017，33(05): 40-49. DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.006.

[5] 葛秀杰，高雅，李德興，葛廣路.等溫滴定量熱儀的校準方法與程序實現[J].儀器儀表學報，2021，42(02): 1-9. DOI:10.19650/j.cnki.cjsi.J2006807.

[6] 項瑾，梁毅，陳楠.等溫滴定量熱法和熒光滴定法研究十二烷基硫酸鈉與纖維素酶的結合[J]. 化學學報，2003(12): 1949-1954.

[7] 石會剛，陳東戎.等溫滴定量熱法研究核糖開關aac與氨基糖苷類抗生素的相互作用[J]. 生物物理學報，2015，31(03): 241-250.

[8] 余丹丹,鄔瑞光.等溫滴定量熱技術在藥物研究中的應用[J]. 中草藥, 2018, 49(22): 5463-5467.

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