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激光共聚焦顯微鏡中的“點掃描”與“面掃描”

來源：時間：2025-02-20 09:51:03 瀏覽：1802次

激光共聚焦顯微鏡中的“點掃描”與“面掃描”

激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）作為一種高性能的光學顯微成像技術，以其高分辨率、三維成像能力和非侵入性特點，在生物學、醫學研究等領域中發揮著重要作用。在CLSM成像技術中，“點掃描”與“面掃描”是兩種不同的掃描方式，它們各自具有獨特的工作原理、成像特點和應用場景。

一、點掃描共聚焦顯微鏡

1. 工作原理

點掃描共聚焦顯微鏡使用激光作為光源，通過一個微小的光束掃描樣品。樣品中的熒光分子在激光激發下發光，這些熒光信號通過一個針孔被檢測，只有來自焦平面的熒光信號能夠通過針孔到達探測器。這樣可以有效排除焦平面以外的信號，提高圖像的分辨率和對比度。

具體來說，點掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經照明針孔形成點光源，對標本內焦平面的每一點進行掃描。標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點或逐線接收，迅速在計算機監視器屏幕上形成熒光圖像。在此過程中，照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發射針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，從而實現了共聚焦成像。

2. 成像特點

高分辨率：由于點掃描方式可以精確控制激光束的位置和大小，因此能夠實現高分辨率的成像。

光學切片能力：點掃描共聚焦顯微鏡能夠排除焦平面以外的信號，從而實現對樣品的光學切片，獲取特定深度下的圖像。

三維成像：通過逐層掃描樣品并疊加圖像，可以構建出樣品的三維結構。

3. 應用場景

點掃描共聚焦顯微鏡因其高分辨率和良好的光學切片能力而廣泛應用于細胞生物學和組織學研究。它能夠提供高質量的三維圖像，適用于固定細胞和組織的詳細結構分析。然而，點掃描共聚焦的成像速度相對較慢，光毒性較強，可能不適合長期或高速的活細胞成像，以及大組織樣本的數據采集。

二、面掃描共聚焦顯微鏡（轉盤共聚焦為例）

雖然嚴格意義上的“面掃描”共聚焦顯微鏡并不常見，但轉盤共聚焦顯微鏡（Spinning Disk Confocal Microscopy）在一定程度上實現了類似面掃描的效果，它通過快速旋轉的轉盤和多個針孔同時工作，提高了成像速度。

1. 工作原理

轉盤共聚焦顯微鏡使用一個帶有微透鏡陣列的轉盤來增加照明效率和采樣速率。轉盤上的每個微透鏡都對應一個針孔，當轉盤旋轉時，激光束通過微透鏡陣列被分散到樣品的多個點，同時多個針孔同時工作收集熒光信號。這樣，相比于點掃描方式，轉盤共聚焦可以提供更快的成像速度和較低的光毒性。

2. 成像特點

高速成像：轉盤共聚焦顯微鏡的成像速度遠快于點掃描共聚焦顯微鏡，適合動態過程的實時觀察。

低光毒性：由于成像速度快，樣品受到的激光照射時間減少，從而降低了光毒性。

視野和靈敏度：轉盤共聚焦顯微鏡還能提供較好的視野和較高的靈敏度，適用于弱信號的檢測。

3. 應用場景

轉盤共聚焦顯微鏡非常適合動態過程的實時觀察，以及高分辨率下對切片進行快速觀察及數據采集。此外，它還能在弱信號檢測方面發揮優勢。然而，與點掃描共聚焦顯微鏡相比，轉盤共聚焦的分辨率略遜一籌。

三、比較

1. 分辨率

點掃描共聚焦顯微鏡通常具有更高的分辨率，因為它能夠精確控制激光束的位置和大小，從而實現對樣品的高精度掃描。而轉盤共聚焦顯微鏡雖然成像速度快，但在分辨率上可能稍遜于點掃描方式。

2. 成像速度

轉盤共聚焦顯微鏡的成像速度遠快于點掃描共聚焦顯微鏡。這是因為轉盤共聚焦通過快速旋轉的轉盤和多個針孔同時工作，提高了采樣速率和照明效率。因此，轉盤共聚焦更適合動態過程的實時觀察和快速數據采集。

3. 光毒性

由于成像速度快，轉盤共聚焦顯微鏡對樣品的光毒性較低。而點掃描共聚焦顯微鏡由于需要逐點掃描樣品，因此可能對樣品造成較大的光損傷。然而，隨著技術的不斷發展，點掃描共聚焦顯微鏡也在努力降低光毒性，以適應更廣泛的應用場景。

4. 應用領域

點掃描共聚焦顯微鏡因其高分辨率和光學切片能力而廣泛應用于細胞生物學、組織學研究以及生物醫學研究中的固定細胞和組織的詳細結構分析。而轉盤共聚焦顯微鏡則更適合動態過程的實時觀察、弱信號檢測以及高分辨率下對切片進行快速觀察及數據采集等領域。

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