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    ?細胞熱遷移分析技術cetsa的具體原理和實驗流程
    來源： 時間：2024-11-29 11:29:19 瀏覽：19383次

    ?細胞熱遷移分析技術cetsa的具體原理和實驗流程

     

    一、基本原理

    細胞熱遷移分析技術（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是一種用于檢測細胞內藥物與靶蛋白結合效率的實驗技術，其基本原理是基于蛋白質的熱穩定性；在細胞內，當藥物與靶蛋白結合時，靶蛋白的結構會變得更加穩定，從而在升高的溫度下不易發生變性，因此，與未結合藥物的蛋白相比，結合了藥物的蛋白在相同的溫度下會有更多的未降解蛋白；這一現象可以通過測量不同溫度下的蛋白降解情況來觀察，通常使用免疫印跡（Western blotting）或質譜（MS）等方法進行檢測。

    二、實驗流程

    1. 細胞準備

    細胞培養：選擇合適的細胞系，如HEK 293T細胞，進行培養；確保細胞處于良好的生長狀態。

    轉染：如果需要，將構建好的質粒瞬時轉染到細胞中，以便在細胞內表達特定的蛋白；通常使用脂質體轉染試劑，按照制造商的方案進行操作。

    藥物處理：將細胞暴露于DMSO（對照組）或待測試的藥物中，孵育一定時間（例如24小時），以確保藥物充分與靶蛋白結合。

    2. 細胞裂解

    洗滌：收集細胞，用含有蛋白酶抑制劑（如1 mmol/L PMSF或50×cocktail）的PBS洗滌細胞，以防止蛋白降解。

    重懸：將細胞重懸于PBS中，調整細胞密度至2×10^7 cells/ml。

    3. 溫度梯度處理

    分裝：將細胞分裝到多個PCR管中，每管含有相同數量的細胞。

    加熱：將PCR管置于熱循環器中，在不同的溫度（例如37℃至67℃）下加熱3分鐘，使蛋白質變性；每個溫度點設置至少三個重復樣本，以確保結果的可靠性。

    4. 細胞裂解和凍融

    裂解：將加熱后的細胞重懸于NP40緩沖液中，用液氮進行3次凍融循環，以徹底裂解細胞。

    離心：將裂解后的細胞懸液在4℃、20,000×g離心20分鐘，收集上清液；上清液中含有未降解的蛋白，而沉淀物中則是已經降解的蛋白。

    5. 蛋白檢測

    Western blotting：取20 μL上清液，加入等量的2×SDS loading buffer，沸水浴中滅活10分鐘；然后進行SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜上，用特異性抗體進行免疫印跡，檢測目標蛋白的表達量。

    質譜分析：如果需要進行高通量檢測，可以將上清液送至質譜公司進行蛋白質譜分析，以獲得更詳細的蛋白信息。

    三、應用

    1. 藥物靶點驗證

    藥物結合：CETSA可以驗證藥物是否與預期的靶蛋白結合，通過比較藥物處理組和對照組的蛋白降解情況，可以確定藥物與靶蛋白的結合效率。

    脫靶效應：CETSA還可以用于檢測藥物的脫靶效應，即藥物是否與非預期的蛋白結合；這有助于評估藥物的安全性和特異性。

    2. 蛋白-蛋白相互作用

    相互作用驗證：CETSA可以用于研究細胞內蛋白-蛋白相互作用，通過觀察不同溫度下蛋白的降解情況，可以判斷兩種蛋白是否發生相互作用。

    相互作用強度：CETSA還可以提供關于蛋白-蛋白相互作用強度的信息，這對于理解生物過程中的調控機制非常重要。

    3. 藥物篩選

    高通量篩選：結合質譜技術（MS-CETSA），CETSA可以用于高通量篩選潛在的藥物候選物；通過大規模的溫度梯度實驗，可以快速鑒定出與目標蛋白結合的化合物。

    四、局限性

    盡管CETSA技術具有許多優點，但也存在一些局限性：

    靈敏度：并非所有蛋白-蛋白相互作用都會產生明顯的CETSA位移，因此某些相互作用可能難以檢測。

    結構信息：CETSA通常無法提供具體的結構信息，特別是當蛋白質存在多個相互作用對象時。

    細胞定位：CETSA無法直接提供藥物在細胞內的具體定位信息，需要結合其他技術進行進一步研究。

     

    評論 / 文明上網理性發言
    12條評論
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    全部 3小時前 四川
    文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具?，F代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字，很多小語種，有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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