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                WB實驗中的轉膜與抗體結合步驟詳解
                來源: 時間:2024-01-08 09:59:01 瀏覽:3697次

                WB實驗中的轉膜與抗體結合步驟詳解

                 

                蛋白質免疫印跡(Western blotWB是一種檢測蛋白質表達水平和分子量的技術WB實驗包括樣品制備、SDS-PAGE電泳、轉膜、抗體結合及顯色等多個步驟。


                一、轉膜

                轉膜是將SDS-PAGE電泳分離后的蛋白質轉移到固定在固相支持物上的過程,轉膜方法有向上毛細管轉移、向下毛細管轉移、電轉移和真空轉移等;固相支持物主要有硝酸纖維素膜和尼龍膜,硝酸纖維素膜是非共價結合,易脆,而尼龍膜是帶正電荷的,高強度,不易破損,具有較大的DNA結合容量,在轉膜過程中,需要將分離膠上的蛋白質完全轉移到膜上,以便后續的抗體結合和檢測。

                二、抗體結合

                抗體結合是WB實驗的核心步驟,主要包括一抗孵育、洗滌、二抗孵育和洗滌等過程。

                1. 一抗孵育:將特異性一抗添加到轉膜后的膜上,孵育過程中一抗與目標蛋白質發生結合,一抗的濃度和孵育時間需要根據實驗需求進行調整;一般情況下,一抗的濃度在1:1000-1:10000之間,孵育時間為1-2小時,在孵育過程中,需要保持膜的濕潤,可以使用封閉液或抗體稀釋液進行濕潤。

                2. 洗滌:用緩沖液(如TBST)反復洗滌膜上未結合的一抗洗滌的次數和時間需要根據實驗情況進行調整,一般洗滌3-5次,每次5-10分鐘;洗滌的目的是去除未結合的一抗,避免后續的顯色反應受到干擾。

                3. 二抗孵育:將與一抗匹配的二抗加入到膜上,孵育過程中二抗與一抗結合,二抗的濃度和孵育時間也需要根據實驗需求進行調整;一般情況下,二抗的濃度在1:1000-1:10000之間,孵育時間為1-2小時,同樣需要保持膜的濕潤。

                4. 洗滌:用緩沖液(如TBST)反復洗滌膜上未結合的二抗洗滌的次數和時間需要根據實驗情況進行調整,一般洗滌3-5次,每次5-10分鐘。

                三、注意事項

                1. 在轉膜過程中,需要控制好轉膜電壓和時間,以及膜的濕度和尺寸,避免影響蛋白質的轉移效率。

                2. 在抗體結合過程中,需要注意一抗和二抗的濃度和孵育時間,避免過度或不足結合。

                3. 洗滌步驟是去除未結合抗體的重要環節,需要充分洗滌,避免背景雜亂。

                4. 實驗過程中需要保持膜的濕潤,避免膜干燥影響抗體結合。

                5. 在顯色過程中,需要均勻涂抹ECL顯色液,避免顯色不均。

                 

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                全部 3小時前 四川
                文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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