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超強干貨丨一文看懂WB、qPCR生物測試，內含常見問題（附答案）

來源：測試GO 時間：2023-02-13 09:53:10 瀏覽：15889次

01

蛋白質印跡（Western blotting）

實驗簡介

蛋白質印跡（Western blotting）又稱免疫印跡（immunoblotting），是采用印跡技術將蛋白質轉移到膜上，再根據抗原-抗體的特異性結合，檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

實驗原理

WB實驗是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離后，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與相對應的第一抗體特異性結合，之后再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

實驗流程

蛋白質印跡常見問題

一、為什么蛋白質印跡條帶大小與預期的不同？

蛋白質印跡是一種基于蛋白質大小來分離蛋白質的技術。一般來講，蛋白質越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實際條帶大小可能與預測的不同。

常見的因素包括：

1.翻譯后修飾：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白質大小。

2.翻譯后切割：例如許多蛋白先被合成為前蛋白，然后被切割產生活性形式，例如前半胱天冬酶。

3.剪接變體和異形體：可變剪接和異形體可能從同一基因產生不同大小的蛋白質。

4.相對電荷-氨基酸（帶電和不帶電）多聚體組分，例如蛋白質的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止，但強相互作用會導致較大的條帶出現。

二、應該上樣多少樣品？

細胞裂解物、膜裂解物和核裂解物：每孔上樣20-30g總蛋白。可根據測試樣品中的蛋白質表達水平進行一些優化。純化蛋白（重組或內源）：上樣10至100ng蛋白。

三、蛋白樣本為什么要進行還原和變性？

為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來打破蛋白的高級結構，變成初級的氨基酸結構，同時以恒定的質量比包被蛋白質，使其帶上負電荷。這一恒定的負電荷比是下一步凝膠電泳分離的關鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來斷開蛋白自身的二硫鍵，進一步使蛋白質變成線性結構。順便提一下，有些抗體只能夠識別目標蛋白的天然結構，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性，所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數蛋白質印跡分析都需要在還原和變性的體系中進行。

四、轉膜選擇半干轉還是濕轉？

常用的轉印方法有兩種，濕法和半干法。這兩種方法的主要區別在于，濕法轉印中，夾心層被浸沒在注有電轉緩沖液的槽中，而在半干法中，夾心層被直接置于陰極與陽極之間。半干法較快，但膜可能會干掉導致蛋白無法轉印。濕法轉印用時較長，但對于大分子蛋白或疏水蛋白等較難轉印的蛋白，這個方法更適合。

五、為什么檢測重組蛋白時難以獲得條帶？

抗體檢測重組蛋白質時，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時，如果重組蛋白帶有標簽，標簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發生的可能性（而不是位于蛋白質的閱讀框中間）。

六、牛奶和 BSA 封閉有區別？

抗體可能對封閉劑敏感，一般來講，BSA會產生更清晰的結果，因為BSA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發生交叉反應。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因為牛奶含有更多種類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質。

七、能否用室溫下孵育一抗 1 小時代替 4 ℃ 過夜孵育？

蛋白質印跡中一抗孵育時間需要用戶進行最終優化。一般來講，4 ℃ 過夜孵育將產生更高效、更特異的染色。但許多抗體在室溫下孵育1或2小時效果也非常好。

實驗結果常常出現的問題

一、無信號

1.一抗和二抗不相容，使用針對一抗來源物種產生的二抗（例如，一抗來源于兔，使用抗兔二抗）。

2.結合到目標蛋白的一抗或二抗不足，使用更高濃度的抗體，或在4℃下孵育更長時間（例如過夜孵育）。

3.封閉劑和一抗或二抗之間發生交叉反應，使用溫和去垢劑，例如Tween20，或更換封閉劑（常用的封閉劑是牛奶、BSA、血清或明膠）。

4.一抗不識別測試物種中的蛋白查看數據表或進行BLASTp比對，檢查抗體是否應與目標蛋白反應。

5.抗原不足，每個泳道上樣至少20–30μg蛋白，使用蛋白酶抑制劑。

6.組織中目標蛋白豐度不夠，利用富集步驟使信號達到最大（例如，對于核蛋白，制備核裂解物）。

7.蛋白轉膜效果差，用可逆染料（例如麗春紅）檢查轉膜情況。如果蛋白未有效轉膜，檢查轉膜方向是否正確。如果使用PVDF膜，確保先將膜預浸在甲醇中，然后預浸在轉膜緩沖液中。

8.膜洗滌過度減少洗滌步驟的數量或縮短洗滌步驟的時間。

二、“微笑”︶條帶呈笑臉狀

說明凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統溫度偏高，這種情況在用較厚凝膠時常發生。

三、“皺眉”︵條帶呈皺眉狀

這種現象常常是由于裝置不合適，特別是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全就會產生這種現象。

四、“拖尾”現象和背景高

拖尾是電泳中最常見的現象，常常是由于樣品溶解不佳引起的。解決辦法為加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液，加增溶輔助試劑，降低凝膠濃度。背景高是封閉時間不夠，延長封閉時間。優化封閉試劑的類型和濃度；封閉試劑和抗體有交叉反應，則需要更換封閉試劑。磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑，推薦BSA封閉；一抗/二抗濃度太高時應降低抗體濃度。洗膜不充分，5*3mins，多次短時間的洗膜；曝光時間過長，應縮短曝光時間。出現干膜現象保證膜充分浸透，避免出現干膜。

五、非特異性條帶現象

在標本制備時，二聚體或者多聚體應增加上樣前煮沸變性時間；蛋白不同剪切體或者異構體存在；若蛋白樣品降解，應使用新制備的標本，標本中加入新配制的蛋白酶抑制劑。上樣品時，上樣量過大，應減少上樣量。封閉不充分，優化封閉時間和封閉試劑濃度。抗體孵育和檢測一抗/二抗濃度是否過高，降低抗體濃度。

測試案例

02

實時定量PCR（RT-qPCR）

實驗簡介

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。

實驗原理

以cDNA為模板進行PCR，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以可以定量。在實時PCR擴增過程中，熒光信號被收集，轉化為成為擴增和熔解曲線。具體數據就是基線，熒光閾值和Ct值。

1.基線（baseline）：一般來講，第3-15個循環的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。

2.閾值（threshold）：閾值一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節，位于指數期就可以。

3.Ct值（Ct value）：Ct值就是熒光值達到閾值時候的PCR循環次數。所以是一個沒有單位的參數。跟初始模板的量呈反比。

檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。

實驗流程

qPCR常見問題分析

一、無Ct值出現

檢測熒光信號的步驟有誤：一般SybrGreen法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。

1.引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。

2.模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

3.模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

二、Ct值出現過晚（Ct>38）

1.擴增效率低：反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

2.PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

3.PCR產物太長：一般采用80-150bp的產物長度。

三、標準曲線線性關系不佳

1.加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。

2.標準品出現降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。

3.引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。

4.模板中存在抑制物或模板濃度過高

四、負對照有信號或者溶解曲線不止一個主峰

1.引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

2.引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

3.鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

4.模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

五、擴增效率低

1.反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

2.反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

3.反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

六、同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？

1.判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性；

2.如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數據用于分析。

七、擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？

1.參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)

2.模板的濃度太高或者降解

3.熒光染料的降解

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