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流式細胞儀FCM如何區分死細胞和活細胞？

來源：時間：2023-02-01 13:47:57 瀏覽：4248次

流式樣品中不可能完全去除死細胞，而在流式分析時又不希望有死細胞的干擾，所以如何在流式分析和流式分選時明確分辨死細胞就成為流式細胞術的一個重要研究內容。目前，有四種方法供流式分析者區分死細胞和活細胞。

對角線死細胞

活細胞能產生非特異性熒光，只是非特異性熒光信號相對于熒光素發射的熒光信號較弱。死細胞也可以產生非特異性熒光，而且死細胞產生的非特異性熒光要明顯強于活細胞，有的甚至強于熒光素產生的熒光信號。非特異性熒光產生的熒光波長沒有選擇性，并不是局限于某一熒光波長范圍，而是處于連續的波長范圍，所以一般所有的熒光通道都能夠接收到死細胞產生的非特異性熒光信號，而且其在所有波長范圍的熒光強度相差不多，各個熒光通道接收到的死細胞的熒光強度都是處于同一個等級的。在散點圖上死細胞是位于對角線上的，而且不同的死細胞，其非特異性熒光的強度不同，且差異可能很大，強度大的可能是強度小的幾十倍，甚至幾百倍。所以從整體來看，死細胞的非特異性熒光強度呈現出從低到高的連續性分布，表現在散點圖上死細胞剛好處于對角線上，如圖A所示呈線型，與活細胞群體的圓形分布有明顯區別。

對角線死細胞流式圖

7AAD標記死細胞

7AAD(7氨基放線菌素D）是一種經典的核酸標記染料，在流式細胞術中能夠代替PI染料用于標記死細胞，以去除死細胞對于實驗結果的影響。PI染料被激發后發射的熒光波長范圍很大，常規FL1、FL2,FL3都能夠接收到其熒光信號，所以與FITC和PE熒光素發射的熒光波長有很大程度的重疊，因此，PI染料不宜與FITC和PE共標記。而同樣標記核酸的7AAD，其發射的熒光波長比較集中，一般被PerCP熒光通道接收，基本不與FITC和PE發射的熒光重疊，可以與FITC和PE共同標記樣品細胞。所以，7AAD在標記死細胞方面要明顯優于PI染料。7AAD的熒光信號被PerCP通道接收，所以7AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯的抗體共同標記樣品細胞。標記7AAD不需要與其他熒光素偶聯抗體同時標記，只需在流式上樣前5min加入適量的7AAD于流式管中，就可上樣分析。分析時將PerCP通道陰性的細胞設門顯示于新的流式圖中即可，此時流式圖中的細胞都是7AAD陰性的活細胞。

PE-Cy5通道非標記陽性細胞

利用PE-Cy5通道非標記陽性細胞區分活細胞和死細胞時，流式圖分析的順序一般是先在FSC-SSC圖中選擇目標細胞所在的細胞群，將其設門，然后將門內的細胞顯示于PE-Cy5-SSC散點圈中，排除PE-Cy5通道非標記陽性細胞代表的死細胞，將PE-Cy5陰性細胞設門，然后將門內的細胞顯示于新的流式圖內分析，這時該流式圖內的細胞都是活細胞，分析或者分選時就可以盡量排除死細胞的干擾了。

PE-Cy5通道非標記陽性細胞

EMA與ViD標記死細胞

只標記分析活細胞的表面抗原分子時，用7AAD鑒別死細胞和活細胞是理想且經典的方法。但是如果分析胞內分子，如檢測胞內的重要抗原分子、胞內細胞因子和胞內活化的激酶等都需要先固定樣品細胞，然后用打孔劑在細胞膜上打孔，使熒光素偶聯抗體能夠通過細胞膜進入細胞內，與相應目標分子結合，這時7AAD就無怯鑒別死細胞和活細胞了。如果在固定細胞前標記7AAD，固定和打孔的過程可能會使7AAD發射熒光的能力丟失，如果在上樣前標記7AAD，那所有的細胞都會被標記，因為7AAD也可經過小孔進入細胞內部與DNA結合。這時，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反應性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞內分子時用于鑒別死細胞和活細胞。