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                實時熒光定量PCR(qPCR)的實驗步驟解析
                來源: 時間:2022-12-29 09:33:40 瀏覽:9339次

                qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是實時熒光定量PCRqPCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

                TakaRa 試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time),SYBRGreenⅠ法。

                實驗步驟:

                一,去除基因組DNA反應(yīng):

                全波長酶標(biāo)儀測出RNA濃度(單位ng/ul);按照以下劑量配制10ul體系

                試劑使用量
                5×gDNA Eraser Buffer2 μl
                Buffer 2.0 μl gDNA Eraser1 ul
                Total RNA1ug/RNA濃度
                RNase Free dH2OUp to10 ul

                PCR程序:42℃ 2min

                4℃ ∞

                二,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):

                按照以下劑量配制20ul體系:

                試劑使用量
                步驟 1 的反應(yīng)液10 ul
                PrimeScript RT Enzyme Mix I1 ul
                RT Primer Mi1 ul
                5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 ul
                RNase Free dH2O4 ul
                Total20 ul

                PCR程序:37℃ 15min

                85℃ 5s

                4℃ ∞

                三,Real Time PCR

                按照以下劑量配制20ul體系:

                試劑使用量
                SYBR@ Premix Ex TaqII(2X)10 ul
                F Primer(10uM)0.8 ul
                R Primer(10uM)0.8 ul
                ROX Reference II0.4 ul
                反應(yīng)2的DNA模板2 ul
                ddH2O6 ul

                四,儀器設(shè)置

                儀器使用的是熒光定量PCR儀Q6-96,設(shè)置界面如下圖:

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                全部 3小時前 四川
                文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產(chǎn)生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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