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冷凍電鏡的基本原理與應用

來源：時間：2022-12-06 14:55:02 瀏覽：4532次

1.引言

先進電子顯微技術為從微觀基礎上解析宏觀物質的性質提供了有力的技術支持，但受限于電子顯微鏡的工作原理，以及含大量水分的生物樣品的特殊性，它在生物科學研究領域的應用受到了嚴重限制。冷凍電子顯微技術（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）的現世為這一局限填補了空白，采用樣品冷凍——低劑量電子斷層掃描——三維重構的方案，科學家們順利得到了大分子生物樣品的電子顯微相。而隨著硬件儀器和解析軟件的發展，冷凍電鏡的圖像分辨率大大提升，應用范圍也得到了進一步擴展，不僅限于生物材料結構研究，還可用來廣泛研究對電子束、熱敏感的特殊材料。冷凍電鏡也將于未來在材料科學研究領域里開辟出一片嶄新的天地。

2.前世今生——冷凍電子顯微技術的歷史

2017年10月4日，諾貝爾化學獎被授予冷凍電鏡領域的3位科學家，以褒獎他們在“開發冷凍電鏡用以高分辨率測定溶液中生物分子的結構”方面的貢獻。這條消息甫一公布，就引起了人們的調侃，稱：“冷凍電鏡是授予物理學家的化學獎以獎勵他們對生物領域的杰出貢獻。”這一獎項的頒布將冷凍電子顯微帶入了大眾的視野，更體現了生物與物理、數學和計算機技術的多學科融合帶來的技術突破。

回顧冷凍電子顯微鏡的誕生歷程，我們會發現多學科技術融會貫通所帶來的神奇靈感碰撞。

1924年，“物質波”假說的提出奠定了電子顯微技術的基礎，經過長足的發展與應用，以掃描電子顯微鏡（SEM）與透射電子顯微鏡（TEM）為主的電子顯微儀器在對樣品的結構解析與微觀成分表征都發揮了強大的實力，但卻在生物材料領域碰了壁，這是由于：

（1）高能入射電子束會對生物樣品造成輻射損害，嚴重破壞樣品的結構；

（2）生物樣品中通常含有豐富的水分，在高真空環境下水分脫出會嚴重破壞電子束傳播，同時造成樣品結構的崩塌；

（3）生物樣品主要由C、O、N、H等輕質元素組成，成像襯度很低，產出圖像的質量受到了限制。

20世紀50年代，人們采用負染色技術來固定生物結構并對其進行電鏡觀察。這種實驗方法操作簡單，圖像襯度高，但獲得的電鏡照片分辨率只能達到十幾埃左右。

1974年，Kenneth A.Taylor和Robert M.Glaeser在-120℃觀察生物樣品時成功獲取了冷凍水合過氧化氫酶的高分辨圖像信息[2]。這個工作中發現了冷凍樣品有助于減低樣品的輻照損傷，標志著冷凍電鏡應用于生物物理學領域的開始。

1980年，Jacques Dubochet在薄膜純水玻璃化的制備技術上取得了突破性的進展[3]。他采用的液態乙烷浴冷凍法具有快速高效的優點，一直沿用至今。

由于透射電鏡只能獲得二維投影圖像，需要建立算法邏輯，搭建起二維圖像與三維結構的映射關系。

1968年，Aaron Kulg提出了從二維圖像重構三維物體的基本數學原理，也稱中心界面定理，奠定了三維重構技術的基礎[4]。

1987年，Max Radermacher和Joachim Frank等人提出了斷層掃描成像法和單顆粒分析法[5]。單顆粒分析技術能夠嚴格控制對樣品的輻照損傷，是今天冷凍電鏡領域廣泛使用的大分子結構解析方法的基礎。

2008年，加州大學洛杉磯分校的周正洪教授通過一萬兩千多張單顆粒圖像，成功獲得了3.9?分辨率的CPV病毒三維結構[6]。這是第一次通過單顆粒冷凍電鏡重構技術得到近原子分辨率的結構。

2013年以來，由于電子直接探測器（Direct electron-detector device，DDD）的發展，冷凍電鏡取得了革命性的進步。加州大學舊金山分校程亦凡教授研究組成功利用新一代DDD相機解析得到了瞬時受體電位通道蛋白（TRPV1）的3.4?分辨率結構[1]。這項研究打破了不結晶膜蛋白側鏈的分辨率屏障，展示了單顆粒冷凍電鏡在膜蛋白分析上的巨大潛力。

3.廬山真面——冷凍電子顯微鏡的原理與結構

冷凍電子顯微技術的發展與完善經歷了復雜而艱辛的探索，下面，我們將深入解析冷凍電子顯微鏡的工作原理、流程與儀器結構，揭開它的廬山真面目。

3.1 工作原理

3.1.1 樣品制備：樣品快速冷凍技術

樣品的原位冷凍固定處理是低溫電子顯微鏡標本制備的第一步，其過程如下圖所示[7]。

冷凍電鏡采用的快速冷凍技術關鍵在于“快速”。這是由于：采用常規冷凍手段，水分子會在氫鍵作用下形成冰晶，一來會改變樣品結構，二來在成像過程中，冰晶體會產生強烈的電子衍射掩蓋樣品信號。而當冷凍速率足夠快時，水分子在形成晶體之前就會凝固成無定形的玻璃態冰，具有非晶態特性，保證了在電子束探測成像的過程中不會對樣品成像造成干擾。

冷凍固定時，樣品首先放置在由液氮冷卻的容器中，隨后被快速浸入液態乙烷中。采用液態乙烷作為冷凍劑的目的是為了使冷凍速率足夠快，在冷凍過程中，樣品將以每秒104至106 K的速度被快速冷卻。生物樣品中的水被玻璃化冷凍后，樣品結構就得到了保持和固定，同時玻璃化冰也不會在真空環境中揮發，在一定程度上保護了樣品免受電子輻射的損傷。

3.1.2 樣品成像：低劑量輻照成像

普通的樣品材料在進行TEM表征時，電子劑量越高，成像質量越好。但生物樣品受到的輻照損傷卻是和累積的輻照總劑量相關的。更詳細一點說，隨著輻照劑量的增加，輻照損傷對高分辨細節的破壞更嚴重。因此，為了盡可能地獲得更多的細節，就必須要對樣品采用用低劑量輻照成像。

在冷凍電鏡技術中，常用的低劑量輻照成像法有兩種：冷凍電子斷層掃描法，單顆粒分析成像法。

（1）電子斷層掃描技術（cryogenic computed tomography）

進行斷層掃描時，樣品被連續不停地旋轉，并在每個旋轉角度上都進行一次成像。每一幅電子顯微像是物體在不同投影方向的二維投影像, 經傅立葉變換會得到一系列不同取向的截面，當截面足夠多時，會得到傅立葉空間的三維信息，再經傅立葉反變換便能得到物體的三維結構。

（2）單顆粒分析法（Single particle analysis, SPA）

單顆粒技術獲得投影的具體方法如圖4：制備很多具有同樣結構的大分子樣品，將其進行分散冷凍后進行隨機的投影拍照，再通過計算模擬測定角度，對具有相同角度的粒子進行組合，突出其中更特殊、更容易解釋的特征。

單顆粒冷凍電鏡是針對單個粒子進行重構的技術，但我們的研究對象往往是多構象或結構異質的蛋白，顆粒之間存在細微差別，這是一些蛋白質無法獲得高分辨結構的重要原因之一。對于結構異質性樣品的分析，我們需要首先將樣品分成幾個同質的子集，然后分別進行三維重建。

由于單顆粒分析法理論成像分辨率更高，尤其在分析具有同質性結構的樣品時表現出更方便、更優異的成像能力，因此得到了更廣泛的應用。單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可是不具有任何對稱性的蛋白分子或復合體，尤其是針對核糖體的表征。

（3）電子斷層掃描技術與單顆粒分析法的比較：

單顆粒分析法：

優點：解析生物大分子的理論分辨率可達原子級；樣品受總輻射值小；對稱顆粒的解析分辨率更高；分子量越大，結果越好；

缺點：對樣品的重復性有非常苛刻的要求，只能用于對經過提純的結構穩定的生物大分子的三維重構。

電子斷層掃描技術：

優點：簡單直接；對樣品的要求較低；常用于對細胞或者生物組織結構的三維重構；

缺點：對同一樣品位置多次拍照時，電子束對樣品的輻照損傷就成為了比較嚴重的問題；樣品旋轉角度受到電子束透過樣品厚度能力的限制。

3.1.3 三維重建

透射電子顯微鏡所成圖像是物體的投影像，類似于X射線光片。通過使用投影切片定理（圖5），可以組合從一個視角范圍拍攝的物體的許多圖像（2D投影）來生成物體的三維重建。

在理想的單顆粒成像條件下，玻璃冰中的蛋白質隨機分布，如果使用了大量的粒子圖像，則可以實現各向同性的重建。這與電子斷層掃描相反，電子斷層掃描由于樣品的幾何形狀而限制了視角，從而實現了各向異性的重建。

3.2 工作流程

單顆粒冷凍電鏡的工作流程如下：

第１步：樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個特制的樣品載網上。載網由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網迅速投入到液態乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質分散固定在玻璃態的冰膜中。

第２步：電鏡圖像采集。選擇最有可能產生最佳圖像的最佳顆粒密度和玻璃態冰厚度的樣品，設定最佳的參數（比如：欠焦值、放大倍數和電子劑量等），記錄這些樣品區域的大量圖像，用手工或半自動程序框取那些離散的分子形成的投影圖。

第３步：三維結構搭建。由于電子可能對非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個初始的3D模型，然后對捕獲的單顆粒2D圖像進行分選。

3.3 儀器結構

冷凍電子顯微鏡的儀器結構與透射電子顯微鏡的基本結構相似，只是在進樣之前搭載了液態乙烷罐與冷凍倉，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉移至樣品倉內。

（1）冷凍室：在實際操作中，向液態乙烷中投入樣品時，乙烷會在樣品周圍快速沸騰，形成絕緣氣態膜，減慢向低溫液體的熱傳遞，稱為萊頓弗羅斯特效應。因此要使厚度超過幾微米的樣品中的水以足夠高的冷卻速度產生非晶冰非常困難。冷凍室中加入旋轉葉片真空泵將冷凍劑泵入，可以提高冷卻速度。

（2）電子槍：產生電子束的部分，聚光鏡系統負責將電子束聚焦到樣本樣品上。

（3）圖像生成系統：由物鏡，中間和投影儀鏡頭以及可移動平臺組成。

（4）圖像記錄系統：收集來自樣品的電子信號，在熒光屏上形成圖像。

3.4 優勢與不足

冷凍電鏡已經能解析出生物大分子的原子級分辨率（0.2-0.3 nm）結構，但是這一結果離物理極限還有較大距離。并且基于生物大分子樣品的成像特殊性，目前依然存在如下不足。

（1）樣品制備的困難。樣品制備的關鍵要求是顆粒朝向必須是隨機分布的，但樣品制備過程操作會對顆粒的隨機分布造成影響。

（2）要求樣品結構均一性。多個顆粒的圖像數據必須進行合并和平均以形成3D重構圖，若要實現高分辨率，就必須保持樣品結構的均一。

（3）蛋白顆粒構象多樣。理論上說，單顆粒冷凍電鏡的一大優勢就在于能區別不同的功能構象，但是有時候不同的構象相似度太高，導致區別起來非常棘手。

（4）成像理論需要進一步研究。冷凍電鏡現有的成像理論是一種數學上的近似法。如果要進一步提高結構解析的分辨率，就需要用到更為復雜的電鏡成像理論來提取圖像。近年來，在單顆粒分析中取得重大突破的是最大似然估計理論，它在圖像匹配、2D和3D分類與模型優化上均有應用，是一個強有力的理論工具。但過多的計算資源消耗阻礙了這個方法在冷凍電鏡單顆粒重構中的廣泛應用，如何在加快計算速度的同時，提高模型重構的準確性是最大似然估計算法的一個重要問題。

4.大顯神通——冷凍電子顯微技術的應用

4.1 結構生物學

從歷史維度上看，冷凍電鏡技術在結構生物學領域的功勛建樹無需贅述。2020年年初，新型冠狀（2019-nCoV）病毒疫情席卷全球，冷凍電鏡技術在解析病毒結構、推測其侵染人體細胞的路徑等傳播原理發揮了重要作用，為人類攻堅疫情防護、研發疫苗提供了重要的理論依據。

病毒要進入人體細胞，就必須與人體細胞上相應的受體蛋白結合。新冠肺炎疫情暴發以來，新冠病毒表面與宿主細胞作用的關鍵刺突蛋白（S蛋白，Spike glycoprotein）備受各研究團隊的重視。得克薩斯大學的McLellan研究組采用冷凍電鏡技術，獲得純化S蛋白的3207張照片，結合已經公開的新冠病毒序列，獲得了經過3D重建的分辨率為3.5 ?的S蛋白三聚體結構[10]。

研究團隊將新冠病毒的結構與其他幾種冠狀病毒進行了比較。如圖8，發現2019-nCoV的S蛋白整體結構與SARS病毒S蛋白的整體結構相似，各個結構之間具有高度同源性。它們之間最大的差異是RBD在其各自的“向下”結構中的位置差異。

結合冷凍電鏡獲取的病毒結構與表面等離子共振技術（SPR）的分析結果，研究團隊表明，新冠病毒的S蛋白結合人體ACE2（宿主細胞受體血管緊張素轉化酶2）的親和力要遠高于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的S蛋白，這解釋了為什么新冠病毒傳染性要比SARS病毒強得多。

4.2 材料科學

Stanford的崔屹教授2017年10月在Science發表了一篇使用低溫電鏡觀察電池中鋰負極材料和界面精細研究的文章，這是冷凍電鏡在材料學研究中應用的一個開端[11]。

鋰枝晶是鋰電池中最大的安全隱患，但鋰元素非常活潑、對環境敏感的特質使得從原子層面解析鋰枝晶的生長機理成為一個極具挑戰的課題。傳統的TEM電子束能量很高，會嚴重損壞枝晶結構，受到冷凍電鏡觀察敏感生物材料的啟發，崔屹教授等人使用冷凍電鏡技術首次獲得了鋰枝晶原子分辨率級別的結構圖像。

與傳統電鏡觀察到的不規則形狀不同，高分辨的冷凍電鏡照片中顯示的鋰枝晶是呈長條狀的完美六面晶體，其生長行為顯示其有明顯的<111>優先取向，也就是說，鋰枝晶生長過程中可能發生“拐彎”，但是并不會形成晶體缺陷。

崔屹教授的研究結果成功還原了鋰金屬在溫和環境下的結構圖像，更貼近現實，而且證明冷凍電鏡測試技術可以有效地對脆弱、不穩定的電池材料進行高分辨率表征，例如鋰硅、鋰硫等，并且保持它們在真實電池中的原始狀態。

5.來日可期——總結與展望

長久以來，冷凍電鏡在結構生物學領域取得了巨大成功，目前，多構象蛋白的三維分類問題和生物大分子的動力學分析依然是充滿挑戰的研究方向，新型的算法發展也將主要圍繞這些問題展開。而作為一種低信號源激發測試技術，冷凍電鏡技術在一些對電子束、熱敏感材料，如鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點等精細結構的物理表征與機理研究中也具有巨大的應用潛力。他山之石，可以攻玉。隨著硬件設備與模擬算法的改進，這項引領結構生物化學研究邁入新紀元的技術，未來必定擁有更加廣闊的應用前景。

參考文獻

[1] Cryo‐electron microscopy - a primer for the non‐microscopist[J]. The FEBS Journal, 2013, 280(1).

[2] Taylor K A, Glaeser R M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens[J]. Journal of Ultrastructure Research, 1976, 55(3):448-456.

[3] Dubochet J , Lepault J , Freeman R , et al. Electron microscopy of frozen water and aqueous solutions[J]. Journal of Microscopy, 1982.

[4] De Rosier D J , Klug A . Reconstruction of Three Dimensional Structures from Electron Micrographs[J]. nature, 1968, 217(5124):130-134.

[5] Radermacher M , Wagenknecht T , Verschoor A , et al. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli[J]. Journal of Microscopy, 1987, 146(Pt 2):113-136.

[6] Maofu, Liao, Erhu,et al. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy[J]. Nature, 2013.

[7] Fuest M , Nocera G M , Modena M M , et al. Cryofixation during live﹊maging enables millisecond time orrelated light and electron microscopy[J]. Journal of Microscopy, 2018, 272(2).

[8] Subramaniam S (2006) The SIV surface spike imaged by electron tomography: one leg or three? PLoS Pathog 2, e91

[9] Carroni M , Saibil H R . Cryo electron microscopy to determine the structure of macromolecular complexes[J]. Methods, 2016, 95:78-85.

[10] Wrapp D , Wang N , Corbett K S , et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation[J]. Science, 2020, 367(6483):eabb2507.

[11] Li Y, Li Y, Pei A, et al. Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo-electron microscopy[J]. Science, 2017, 358: 506-510.

[12] Bai X C , Yan C , Yang G , et al. An atomic structure of human γ-secretase[J]. Nature, 2015.

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