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電子順磁共振波譜儀（上）：儀器原理與應(yīng)用

來(lái)源：測(cè)試GO 時(shí)間：2021-01-21 18:10:08 瀏覽：18743次

1引言

1895年，荷蘭物理學(xué)家Zeeman發(fā)現(xiàn)在磁場(chǎng)的作用下，光譜的譜線產(chǎn)生分裂，且譜線分裂程度與磁場(chǎng)強(qiáng)度相關(guān)的現(xiàn)象，稱為“Zeeman效應(yīng)”[1]。

2發(fā)展歷史

圖1

電子順磁共振(Electronparamagneticresonance,EPR)技術(shù)是利用未成對(duì)電子對(duì)順磁性物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)信息分析的波譜學(xué)檢測(cè)法。EPR技術(shù)發(fā)源于物理學(xué)研究，最初用來(lái)研究某些復(fù)雜原子的電子結(jié)構(gòu)、原子偶極矩與分子結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)等問(wèn)題，后來(lái)延伸到了生物化學(xué)領(lǐng)域中對(duì)有機(jī)化合物的分析表征。目前，EPR測(cè)試技術(shù)已在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、能源科學(xué)等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。值得一提的是，EPR能在不影響反應(yīng)的前提下，獲取正在進(jìn)行的物理和化學(xué)反應(yīng)中的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息和動(dòng)態(tài)信息，是一種有效的原位機(jī)理解析手段。

1925年，Uhlenbeck等提出電子的磁矩是由電子的自旋運(yùn)動(dòng)貢獻(xiàn)的。

1945年，F(xiàn)renkel及其合作者在使用133MHz的交變電磁波照射CuCl2·2H2O樣品時(shí)檢測(cè)到了電磁波被共振吸收的信號(hào)，從此宣告了“電子磁共振”的誕生。并證明了更高的微波頻率和更高的外磁場(chǎng)條件更有利于檢測(cè)到EPR信號(hào)。

1946年，美國(guó)哈佛大學(xué)的Purcell等在實(shí)驗(yàn)室中觀測(cè)到了“核磁共振”(Nuclearmagneticresonance,NMR)現(xiàn)象。

1952年，Hutchison采用EPR技術(shù)獲得了第一個(gè)有機(jī)自由基的波譜結(jié)果，是首次將EPR技術(shù)應(yīng)用在非物理學(xué)領(lǐng)域，并引起了化學(xué)家、生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家的廣泛關(guān)注。

20世紀(jì)50年代，磁共振譜儀得到了極其快速的發(fā)展。60年代末，由于低溫技術(shù)、原位檢測(cè)和自旋捕捉等新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，磁共振譜儀的儀器結(jié)構(gòu)得到了極大的改良和發(fā)展，應(yīng)用范圍得到進(jìn)一步拓廣。

3理論基礎(chǔ)

3.1磁共振原理

原子中的電子能進(jìn)行兩種運(yùn)動(dòng)：一種是圍繞原子核的軌道運(yùn)動(dòng)，一種是圍繞通過(guò)其中心的軸所作的自旋運(yùn)動(dòng)，兩種運(yùn)動(dòng)分別產(chǎn)生軌道磁矩和自旋磁矩。當(dāng)自由電子處于外加磁場(chǎng)B0中時(shí)，與外加磁場(chǎng)的相互作用將使電子的自旋能級(jí)從簡(jiǎn)并態(tài)分裂為兩個(gè)能級(jí)，這就是電子自旋磁矩在外磁場(chǎng)中能量的塞曼分裂（Zeemansplitting）。如下圖2所示。

圖2

3.2吸收-弛豫-吸收過(guò)程

圖3

3.3場(chǎng)調(diào)制

最廣泛使用的連續(xù)調(diào)波EPR光譜的結(jié)果通常是表現(xiàn)測(cè)量吸收信號(hào)的一次微分值的譜線，這一過(guò)程是依靠一個(gè)外加的高頻調(diào)制場(chǎng)來(lái)將吸收信號(hào)解析出來(lái)的。調(diào)制線圈纏繞在諧振腔的外側(cè)，使產(chǎn)生的調(diào)制磁場(chǎng)方向與外加磁場(chǎng)一致。在慢速掃描的主磁場(chǎng)上再疊加一個(gè)高頻、低幅的調(diào)制磁場(chǎng)，調(diào)制頻率一般為100kHz。通過(guò)相敏檢波器檢測(cè)峰間幅值，可以獲得到吸收信號(hào)的一次導(dǎo)數(shù)信號(hào)。

圖4

由于這種場(chǎng)調(diào)制的方法使用了相敏檢波器，僅有相同頻率調(diào)制的信號(hào)（100kHz）可被檢測(cè)到，這種采用了高頻調(diào)制和相敏檢波的檢測(cè)方法能夠顯著提高信噪比。為了進(jìn)一步提高儀器的分辨率，現(xiàn)代波譜儀還能觀測(cè)二次微分曲線形式的測(cè)量結(jié)果。

4儀器結(jié)構(gòu)

電子順磁共振波譜儀主要由微波橋、電磁鐵系統(tǒng)、傳導(dǎo)系統(tǒng)、微波諧振腔、檢測(cè)系統(tǒng)、調(diào)制系統(tǒng)構(gòu)成。

微波橋：微波橋由產(chǎn)生、控制和檢測(cè)微波輻射的器件組成。微波頻率一般為1≤ν≤100GHz。常用的微波源有速調(diào)管和耿氏二極管。速調(diào)管在波譜儀中廣泛作為微波源被使用，具有穩(wěn)定、高能、噪聲低的優(yōu)勢(shì)，能有效提高儀器分辨率。微波源后緊接著一個(gè)隔離調(diào)制器，用于減弱反射回源，維持微波頻率的穩(wěn)定。

圖5

電磁鐵系統(tǒng)：EPR光譜儀中的電磁鐵系統(tǒng)要求能夠提供強(qiáng)度符合需要的、穩(wěn)定的、均勻的磁場(chǎng)，磁性組件包括磁體和磁場(chǎng)傳感器。EPR光譜儀使用的磁體主要有兩種：第一種是電磁體，通常能夠產(chǎn)生高達(dá)1.5T的場(chǎng)強(qiáng)，適合在Q波段頻率進(jìn)行測(cè)量。第二種是超導(dǎo)磁體，適用于W波段和更高頻率下進(jìn)行操作。根據(jù)工作微波頻率協(xié)調(diào)所需的磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍，從而進(jìn)行磁體種類的選取。

傳導(dǎo)系統(tǒng)：傳導(dǎo)系統(tǒng)負(fù)責(zé)將產(chǎn)生的微波傳導(dǎo)到指定位置，由隔離器、衰減器、環(huán)形器、波導(dǎo)管等重要器件連接而成。產(chǎn)生于微波源的電磁波通過(guò)定向耦合器被分成兩條路徑：一條路徑指向諧振空腔，另一條路徑指向參考臂。在兩個(gè)路徑上都有一個(gè)可變衰減器，能夠精確控制產(chǎn)生微波的功率。在諧振空腔路徑上，微波與樣品相互作用，產(chǎn)生用于分析的共振吸收信號(hào)。在參考臂上，可變衰減器之后有一個(gè)移相器，可在參考信號(hào)和反射信號(hào)之間設(shè)定相位關(guān)系。

諧振腔：諧振腔好比EPR譜儀的心臟，它是一種方形或圓柱狀的金屬盒，用于放置樣品、產(chǎn)生信號(hào)、放大信號(hào)、檢測(cè)信號(hào)。樣品放置在諧振腔中，產(chǎn)生的微弱信號(hào)在諧振腔內(nèi)部通過(guò)共振被進(jìn)一步放大，當(dāng)能級(jí)分裂接近于入射微波光子的頻率時(shí)，就能夠通過(guò)固態(tài)二極管檢測(cè)得出吸收線。諧振腔存儲(chǔ)微波能量的能力由品質(zhì)因數(shù)Q給出，Q值越高，光譜儀的靈敏度越高。

檢測(cè)系統(tǒng)：載有信號(hào)的微波經(jīng)環(huán)形器被傳導(dǎo)出諧振腔，先經(jīng)過(guò)檢波后進(jìn)入100kHz窄頻帶放大器，隨后進(jìn)入相敏檢波器，在這里只檢出與參考信號(hào)的頻率與相位都相同的接收信號(hào)。相敏檢波器輸出的信號(hào)經(jīng)過(guò)放大后送入電腦。

調(diào)制系統(tǒng)：大多數(shù)外部元件，如微波源發(fā)生器和檢測(cè)器等都包含在微波橋接控制中，通過(guò)調(diào)制系統(tǒng)控制輸入及輸出的微波頻率。調(diào)制系統(tǒng)的作用在于降低噪聲、提高譜儀靈敏度。

4.1儀器工作原理

在EPR儀器中，電磁鐵系統(tǒng)產(chǎn)生的磁場(chǎng)與經(jīng)波導(dǎo)管傳導(dǎo)至諧振腔的電磁波相互垂直，也與掃描線圈互相垂直。當(dāng)電磁波的頻率ν0和磁場(chǎng)強(qiáng)度H0滿足共振吸收條件時(shí)，放置在諧振腔中的樣品就要發(fā)生共振而吸收能量。吸收信號(hào)在諧振腔中被放大后，經(jīng)過(guò)相敏檢出放大后即可顯示于示波器上，并被記錄儀自動(dòng)記錄下來(lái)。

4.2制樣要求

（1）氣體樣品的制備：

常見(jiàn)的氣體樣品如測(cè)試香煙中的自由基含量，主要的制樣手段是對(duì)煙氣進(jìn)行富集，以達(dá)到測(cè)試需求的測(cè)試濃度。

（2）液體樣品的制備：

①溶劑選擇：對(duì)于極性大的溶劑，要將樣品放在毛細(xì)管中進(jìn)行測(cè)試，以避免溶劑對(duì)微波的吸收；

②除氧操作：液體中的氧氣對(duì)信號(hào)的干擾非常大，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行通氮或者真空除氧，以保證測(cè)試過(guò)程中能看到精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息；

未除氧

除氧

圖6

③濃度控制：濃度過(guò)大或過(guò)小都會(huì)對(duì)樣品信號(hào)造成干擾，導(dǎo)致精細(xì)結(jié)構(gòu)的丟失，因此選擇適當(dāng)?shù)臐舛葘?duì)測(cè)試結(jié)果有幫助。

（3）固體樣品的制備：

①除潮處理：保護(hù)EPR圖譜細(xì)節(jié)不受影響；

②樣品粒徑：要注意固體樣品的顆粒大小，以免堵塞送樣管；

③稀釋操作：粉末樣品的順磁濃度如果太大也會(huì)對(duì)信號(hào)造成干擾，可以采用干燥硅膠或碳酸鈣進(jìn)行固體稀釋。

（1）溫度作用：溫度對(duì)信號(hào)的影響主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是熱擾動(dòng)對(duì)測(cè)試結(jié)果造成干擾；二是高溫信號(hào)的存活時(shí)間較短，難以捕捉。因此一些諸如固體表面空穴檢測(cè)、過(guò)渡金屬的不穩(wěn)定價(jià)態(tài)測(cè)試等都需要在液氮的低溫環(huán)境中才能較好的采集到信號(hào)。

（2）樣品濃度：樣品濃度過(guò)高時(shí)分子間的距離較近，會(huì)使電子自旋-自旋相互作用更強(qiáng)，影響儀器分辨率；過(guò)低會(huì)接近儀器檢出限，影響結(jié)果的靈敏度。因此需要采用分散劑，對(duì)樣品濃度進(jìn)行合適的調(diào)整。

圖6不同干燥手法對(duì)EPR波譜的影響

圖7

4.3影響因素

（3）磁場(chǎng)調(diào)制：磁場(chǎng)調(diào)制幅度過(guò)大或頻率與譜線過(guò)于接近時(shí)會(huì)影響檢波器的輸出信號(hào)，引起譜線畸變失真。

（4）樣品種類：確定樣品種類及順磁中心性質(zhì)對(duì)調(diào)整微波頻率與磁場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)有著重要的參考價(jià)值。比如水溶液中的樣品，尤其是生物樣品，主要通過(guò)介電過(guò)程吸收微波，而介電損耗在很大程度上受到頻率的影響，因此為了保證能夠有效觀測(cè)到EPR信號(hào)，需要選擇較低的微波頻率。

5應(yīng)用

EPR技術(shù)起源于物理學(xué)研究，但只要能在樣品中形成未成對(duì)電子就能加以研究，其應(yīng)用幾乎遍及一切材料。

5.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化分析

在生物過(guò)程中存在著大量的自由基問(wèn)題，如植物的光合作用、金屬蛋白質(zhì)的催化過(guò)程等。因此，電子順磁共振波譜技術(shù)是在分子及細(xì)胞水平上研究生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵工具。由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)行生物學(xué)活動(dòng)時(shí)，其構(gòu)象就發(fā)生改變，因此可以通過(guò)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析。

圖8

在采用EPR技術(shù)對(duì)生物學(xué)蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)解析的過(guò)程中，可以采用自旋標(biāo)記技術(shù)，逐點(diǎn)定位標(biāo)記自由基，獲取一系列EPR譜圖，從譜圖分析獲取其二維結(jié)構(gòu)，再輔以長(zhǎng)程約束手段，最終獲取完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。在此基礎(chǔ)上，可以定點(diǎn)將標(biāo)記探針引入感興趣的位點(diǎn)，在不干擾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的前提下，追蹤蛋白質(zhì)在生物活動(dòng)中發(fā)生的構(gòu)象改變。

AliseR.Muok等[6]就是根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)思路，采用β修飾的二磷酸腺苷作為自旋標(biāo)記探針，通過(guò)研究標(biāo)記物側(cè)鏈的動(dòng)力學(xué)信息，對(duì)反應(yīng)蛋白標(biāo)記位點(diǎn)的周圍環(huán)境和空間變化進(jìn)行了研究。并且證實(shí)采用β修飾得到的ADP-β-S-SL是一種有效的進(jìn)行雙電子電子共振（DEER）光譜實(shí)驗(yàn)的探針工具。

5.2原位電化學(xué)過(guò)程研究

EPR光譜技術(shù)的一大特點(diǎn)是可在不影響物理、化學(xué)、生物反應(yīng)過(guò)程的前提下對(duì)樣品進(jìn)行表征，因此具有原位表征的潛力。英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的王斌等人[7]應(yīng)用EPR技術(shù)對(duì)活性炭在水溶液中的電化學(xué)電容儲(chǔ)存過(guò)程進(jìn)行了原位檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EPR信號(hào)強(qiáng)度和雙積分值都隨著充電過(guò)程而增加，隨后在放電過(guò)程中可逆的恢復(fù)。

此外，綜合EPR光譜線形及其溫度依賴性分析得知，在活性炭的雙電容行為中存在兩種自旋行為：缺陷處的自旋，產(chǎn)生窄信號(hào)；表面芳族自旋，形成寬信號(hào)。在每種電解質(zhì)溶液中都能夠看到窄信號(hào)的電勢(shì)依賴性響應(yīng)，而寬信號(hào)的變化僅在較高濃度下發(fā)生。結(jié)果表明，窄信號(hào)的增加是由于官能團(tuán)還原形成自由基，引起了未成對(duì)電子密度增加，寬信號(hào)的電勢(shì)依賴性可能與離子進(jìn)一步吸附到活性炭的深層多孔結(jié)構(gòu)中有關(guān)。

圖9

6新式儀器種類

傳統(tǒng)EPR儀器采用的是固定微波頻率、掃描磁場(chǎng)的方法，稱為連續(xù)波-EPR（CW-EPR,continuouswave-EPR）儀器。近些年，隨著附加器件的開(kāi)發(fā)，發(fā)展出了脈沖-EPR和快速掃描-EPR技術(shù)，使EPR技術(shù)進(jìn)入了多樣化領(lǐng)域，能夠獲得更加多樣的信息，樣品測(cè)量范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。

6.1脈沖-EPR

脈沖波激發(fā)EPR技術(shù)實(shí)際上是一種弛豫測(cè)量工具，在脈沖波的激發(fā)下，自旋體系的弛豫現(xiàn)象被放大，能夠提供有別于連續(xù)波激發(fā)共振的信息。

脈沖技術(shù)的實(shí)現(xiàn)只需對(duì)微波源器件進(jìn)行簡(jiǎn)單的附件添加和調(diào)整。在微波源設(shè)置脈沖程序控制開(kāi)關(guān)，就可以輸出具有一定間隔的脈沖微波。脈沖EPR擁有多頻、多共振和任意波形模式。脈沖-EPR的優(yōu)勢(shì)在于：能夠提高g因子分辨率；放大微波功率；使用脈沖微波激發(fā)的共振躍遷信號(hào)無(wú)需經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)調(diào)制就能進(jìn)行檢測(cè)；改變激發(fā)電磁波的脈沖序列，可以獲得有關(guān)順磁化合物的更廣泛信息。但與CW-EPR相比，脈沖-EPR無(wú)法激發(fā)得到整個(gè)光譜信息，且由于帶寬更大，靈敏度受到限制。

圖10

6.2快速掃描-EPR

快速掃描-EPR（RS-EPR,rapidscanning-EPR）技術(shù)結(jié)合了CW-EPR和脈沖-EPR的發(fā)聲原理，更適合用于研究快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。在快速掃描-EPR時(shí)，磁場(chǎng)在比電子自旋弛豫時(shí)間更短的時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行共振掃描。

快速掃描信號(hào)的優(yōu)勢(shì)在于能夠提供全譜檢測(cè)，并且適用于在不飽和情況下提供更高的微波功率，尤其適合低頻EPR成像；快速掃描EPR波譜能夠同時(shí)測(cè)量自旋系統(tǒng)響應(yīng)吸收和色散分量，可以顯著提高信噪比。

與脈沖-EPR相比，快速掃描-EPR具有更高的靈敏度、更佳的空間分辨率、更短的采集時(shí)間，并能在單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)行更多的臨床前成像測(cè)量，這種技術(shù)對(duì)于進(jìn)行臨床體內(nèi)研究尤其重要。

7展望

電子順磁共振波譜是針對(duì)順磁性物體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與反應(yīng)過(guò)程解析的有力表征方式，即使樣品中不存在順磁中心，也能夠采用人工方法形成未成對(duì)電子，因此適用于廣泛的樣品種類。而且隨著外加附件的研究與發(fā)展，電子順磁共振技術(shù)的表征手段更加多樣化，應(yīng)用范圍進(jìn)一步拓寬。更重要的是，它是一門有效的原位表征技術(shù)，因此在研究致癌機(jī)理、臨床反應(yīng)、催化原理等過(guò)程及其中間產(chǎn)物問(wèn)題時(shí)具有強(qiáng)大的分析能力。綜上所述，電子順磁共振波譜在生物醫(yī)學(xué)、電化學(xué)等領(lǐng)域具有無(wú)窮的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

[1]L.R.Nobellectures,Physics:1901–1921(ElsevierPublishingCompany,Amsterdam,1967.500p.80guilders)[J].NuclearPhysicsA,1969,130(3):696-696.

[2]https://en.wikipedia.org/wiki/Zeeman_effect

[3]ProsserKE,WalsbyCJ.ElectronParamagneticResonanceasaToolforStudyingtheMechanismsofParamagneticAnticancerMetallodrugs[J].EuropeanJournalofInorganicChemistry,2016,2017.

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[5]WilfredRaymondHagen.BiomolecularEPRspectroscopy[J].BiomolecularEprSpectroscopy,2014.

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[7]WangB,FieldingAJ,DryfeRAW.Insituelectrochemicalelectronparamagneticresonancespectroscopyasatooltoprobeelectricaldoublelayercapacitance[J].ChemicalCommunications,2018,54(31).

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