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精華|HPLC最實(shí)用的30個(gè)常見問題及對(duì)策（二）

來源：實(shí)驗(yàn)與分析時(shí)間：2015-09-05 20:51:42 瀏覽：5009次

本文授權(quán)轉(zhuǎn)載自實(shí)驗(yàn)與分析

精華|HPLC最實(shí)用的30個(gè)常見問題及對(duì)策（二）

鑒于HPLC在全行業(yè)運(yùn)用越來越廣泛，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室分析人員都應(yīng)該熟練掌握并應(yīng)用HPLC，為此，小編整理了約30條常見HPLC故障及對(duì)策分析方案，分為三天推送，今天是第二篇。昨日帖子有誤故而刪除，為您造成不便，敬請(qǐng)連接。

本文針對(duì)HPLC使用常見故障進(jìn)行了較全面的分析,如輸液泵中的單向閥、泵墊圈、色譜柱、檢測(cè)器的常見故障,并結(jié)合日常工作實(shí)際,提出了一些可參考的做法和解決對(duì)策。以便使用者能及時(shí)注意所述問題,做到有問題及時(shí)解決,這樣既能大大延長(zhǎng)儀器的使用壽命,又能使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。

HPLC常見故障因素

不規(guī)則的基線噪音產(chǎn)生原因

①漏液。 ②流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 ③流動(dòng)相各溶劑不相溶 ④檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問題 ⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 ⑥檢測(cè)器內(nèi)有氣泡 ⑦流通池污染（即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音。） ⑧檢測(cè)器燈能量不足 ⑨色譜柱填料流失或阻塞 ⑩流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常

以上相應(yīng)解決方法
①檢查接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。 ②檢查流動(dòng)相的組成。③選擇互溶的流動(dòng)相

④斷開檢測(cè)器和記錄儀的電源，檢查并更正。 ⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng) ⑥清洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器 ⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 ⑧更換燈 ⑨更換色譜柱 ⑩維修或更換混合器，在流動(dòng)相不走梯度時(shí)，建議不使用泵的混合裝置

保留時(shí)間漂移的故障排除

保留時(shí)間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時(shí)間漂移和保留時(shí)間波動(dòng)。前者是指保留時(shí)間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時(shí)間無固定規(guī)律的波動(dòng)。將此兩種情況區(qū)分開來對(duì)找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無規(guī)律波動(dòng)。事實(shí)上，保留時(shí)間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動(dòng)相所致）等。

保留時(shí)間漂移的幾種最常見的原因如下：

一、色譜柱平衡

如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相完全平衡。通常平衡需要10-20個(gè)柱體積的流動(dòng)相，但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑（如離子對(duì)試劑）則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來平衡色譜柱。流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動(dòng)相成分。

二、固定相穩(wěn)定性

固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會(huì)慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動(dòng)相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。

三、色譜柱污染

保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來源。

樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。避免色譜柱污染最簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。

四、流動(dòng)相組成

流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等。

五、疏水坍塌

當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動(dòng)相不浸潤(rùn)固定相表面而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動(dòng)相浸潤(rùn)固定相，再用高水含量的流動(dòng)相進(jìn)行平衡。色譜柱長(zhǎng)期儲(chǔ)存也會(huì)發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱（如Waters SymmetryShield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如Waters Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌。

為何出現(xiàn)肩峰或分叉？

①樣品體積過大－－用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；

②樣品溶劑過強(qiáng)－－采用較弱的樣品溶劑；

③柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件；

④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品；

⑤進(jìn)樣器損壞－－更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子。

為何出現(xiàn)鬼峰？

①進(jìn)樣閥殘余峰－－每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗；

②樣品中未知物－－處理樣品；

③柱未平衡－－重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）；

④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化劑；

⑤水污染（反相）－－通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水。

為何出現(xiàn)峰拖尾？

①柱超載－－降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相；

②峰干擾－－清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相；

③硅羥基作用－－加三乙胺,用堿致鈍化柱,增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,純化樣品；

④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品；

⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件；

⑥死體積或柱外體積過大－－連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管；

⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱。

除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變？

改變流動(dòng)相組成和溫度；改變柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。

什么是強(qiáng)溶劑、弱溶劑？

改變流動(dòng)相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時(shí)間。在一定條件下，減少保留時(shí)間或縮短分析時(shí)間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時(shí)間或延長(zhǎng)分析時(shí)間的溶劑為弱溶劑。

怎樣才會(huì)使峰位發(fā)生重排？

在分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動(dòng)相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時(shí)間，不會(huì)發(fā)生峰位的重排。

下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動(dòng)相中換了強(qiáng)溶劑；PH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動(dòng)相的組成改變（如加入離子對(duì)試劑三乙基胺等）。

除了在線脫氣，常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些？

加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價(jià)格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實(shí)驗(yàn)室中最常用。目前還是盡量爭(zhēng)取用在線脫氣，方便且效果好。

評(píng)價(jià)一個(gè)色譜柱的最基本指標(biāo)有那些？

評(píng)價(jià)一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對(duì)稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。

為何出現(xiàn)峰展寬？

①樣品體積過大－－用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；

②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展－－進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散；

③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢－－設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn) ；

④檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過大－－設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ；

⑤流動(dòng)相粘度過高－－增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相；

⑥檢測(cè)池體積過大－－用小體積池,卸下熱交換器；

⑦保留時(shí)間過長(zhǎng)－－等度洗脫時(shí)增加強(qiáng)溶劑含量,也可用梯度洗脫；

⑧柱外體積過大－－將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小；

⑨樣品過載－－進(jìn)小濃度小體積樣品。

免責(zé)聲明：本資源來源于實(shí)驗(yàn)與分析，版權(quán)歸原作者所有，本文僅作交流學(xué)習(xí)之用，不作任何商業(yè)用途，若有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系刪除，謝謝理解！

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